核糖體基因區(qū)打靶載體介導(dǎo)FVIII打靶人胚胎干細(xì)胞及其定向分化研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)因其具有高度的自我更新特性和多向分化潛能，在再生醫(yī)學(xué)、組織工程、基因治療等領(lǐng)域都有著巨大的研究和應(yīng)用潛力。近年來，隨著基因打靶技術(shù)在人胚胎干細(xì)胞中的不斷嘗試，使得經(jīng)基因組精確修飾后的干細(xì)胞有望成為實現(xiàn)遺傳病治療的有效方式。然而要充分實現(xiàn)聯(lián)合基因打靶和干細(xì)胞兩種技術(shù)在臨床應(yīng)用的可能，我們還需面對一些潛在的困難，例如自發(fā)同源重組介導(dǎo)基因打靶的低效性，基因組修飾后

2、的安全性等問題。
　　我們研究小組前期的實驗證實，由本室研發(fā)的核糖體基因區(qū)(rDNA)打靶載體(pHrn)能有效介導(dǎo)外源基因定點整合至多種細(xì)胞系的rDNA區(qū)并有效表達(dá)，且一系列臨床細(xì)胞遺傳學(xué)的證據(jù)表明該區(qū)域可能是外源基因停泊的安全位點。在此基礎(chǔ)上，本研究利用pHrn攜帶人凝血因子Ⅷ(FⅧ)表達(dá)框，對hESCs進(jìn)行基因打靶，以期獲得在rDNA區(qū)定點整合FⅧ的hESCs細(xì)胞克隆，并通過檢測打靶后hESCs的干細(xì)胞特性是否改變來初步驗證

3、rDNA區(qū)打靶的安全性。然后將定點整合FⅧ的hESCs分化為適合血友病移植治療的特定組織細(xì)胞，測定分化細(xì)胞的特性和生理功能，為聯(lián)合rDNA區(qū)基因打靶及干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于血友病A的基因治療提供基礎(chǔ)。
　　方法:(1)將pHrnFⅧ質(zhì)粒線性化后，經(jīng)電轉(zhuǎn)和核轉(zhuǎn)兩種方式轉(zhuǎn)染單細(xì)胞化的hESCs，梯度加入G418篩選抗性克隆;(2)挑取篩選出的抗性克隆，利用定點整合PCR及Southen Blot鑒定rDNA區(qū)定點整合FⅧ的陽性hESCs克隆

4、;(3)檢測定點整合FⅧ克隆的干細(xì)胞生物學(xué)特性,包括核型鑒定，堿性磷酸酶染色，干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測;(4)檢測定點整合FⅧ克隆的多潛能性，包括體外定向心肌分化，體外隨機(jī)向三胚層細(xì)胞分化以及體內(nèi)畸胎瘤形成等實驗。(5)由于肝臟是FⅧ的主要合成及分泌器官，因此我們將定點整合FⅧ細(xì)胞克隆定向誘導(dǎo)為肝細(xì)胞，并通過形態(tài)學(xué)觀測、細(xì)胞特異性基因表達(dá)、ICG代謝、PAS糖原染色等實驗來驗證分化后肝細(xì)胞的特性及生理功能;(6)我們還將定點整合FⅧ的細(xì)胞克

5、隆定向誘導(dǎo)為目前廣泛應(yīng)用于體內(nèi)移植治療的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，通過形態(tài)學(xué)觀測、流式細(xì)胞分析、成骨分化、成脂分化、成軟骨分化等驗證分化后MSCs細(xì)胞的特性及生理功能;(7)RT-PCR及ELISA檢測定點整合FⅧ的hESCs以及分化后的肝細(xì)胞和MSCs細(xì)胞中外源FⅧ的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)通過定點整合PCR及Southern Blot，我們獲得了分別經(jīng)電轉(zhuǎn)和核轉(zhuǎn)后定點整合FⅧ的hESCs克隆各一個，分別命名為ET5及

6、NT59;(2)兩株細(xì)胞均保持正常核型且堿性磷酸酶陽性，并表達(dá)SSEA-4，TRA-1-60等hESCs特異性標(biāo)志物，表明仍具備干細(xì)胞的特性;(3)體外分化結(jié)果顯示兩株細(xì)胞均能分化出Nestin、SMA、AFP標(biāo)志物陽性的三胚層細(xì)胞，同時體內(nèi)畸胎瘤切片觀測到了鱗狀上皮、肌肉、消化道等三胚層組織，表明打靶后細(xì)胞仍具備多向分化能力;(4)將ET5細(xì)胞進(jìn)行定向肝細(xì)胞分化后，可見圓形或多邊形等典型肝細(xì)胞樣細(xì)胞;通過RT-PCR、Western

7、Blot、免疫熒光均檢測到了AFP、Alb、AAT、CYP7A1、CYP3A4等肝細(xì)胞特異性基因的表達(dá);分化而來的肝細(xì)胞能成功攝取及排泌ICG染料且PAS染色陽性，初步證明具備成熟肝細(xì)胞的代謝及糖原貯存功能;(5) ET5進(jìn)行定向MSCs分化后的細(xì)胞，在多次傳代后具有與BM-MSCs趨于一致的典型成纖維樣形態(tài)，且增殖能力旺盛;流式分析結(jié)果表明分化而來的MSCs細(xì)胞表面抗原CD34，CD45陰性，CD44，CD73，CD90陽性，與BM-

8、MSCs一致;經(jīng)間充質(zhì)系分化檢測，顯示分化而來的MSCs同樣具備向成骨成脂成軟骨的分化能力;(6)RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ET5、ET5分化而來的肝細(xì)胞及MSCs細(xì)胞中均能檢測到外源FⅧ的轉(zhuǎn)錄，但是ELISA結(jié)果僅檢測到了分化后肝細(xì)胞中FⅧ蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:(1)通過rDNA區(qū)打靶載體成功將FⅧ表達(dá)框定點整合至hESCs的rDNA區(qū);(2)定點整合FⅧ的hESCs仍然保持多向分化潛能;(3)成功將定點整合FⅧ的hESCs