雞胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其誘導(dǎo)分化.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells，ES細(xì)胞)是由動(dòng)物附植前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner Cell Mass，ICM)經(jīng)體外分離培養(yǎng)而建立的克隆細(xì)胞系。ES細(xì)胞是一種全能干細(xì)胞，具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)及分化潛能，能在體外進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，并在一定條件下保持未分化的二倍體狀態(tài)及其全能性，具有形成嵌合體動(dòng)物的能力。本研究探討了分離方法和消化時(shí)間對(duì)雞ES細(xì)胞的影響，并對(duì)分離得到的ES細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，獲得了傳至第5代的ES細(xì)

2、胞；同時(shí)對(duì)ES細(xì)胞向成骨、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．通過藥勺獲取法、濾紙紙環(huán)法和發(fā)環(huán)法三種不同的方法分離雞X期胚盤細(xì)胞，通過對(duì)三種分離方法的反復(fù)實(shí)驗(yàn)比較，最終得出藥勺獲取法在分離胚盤時(shí)操作簡(jiǎn)單、方便、節(jié)省時(shí)間且易于獲得完整的胚盤。 2．將胚盤細(xì)胞分別消化2、5、8和11min并進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，計(jì)算所形成的克隆數(shù)。在原代培養(yǎng)過程中消化11min的細(xì)胞形成的克隆極顯著低于其他消化時(shí)間(P<0.

3、01)。而在第4代時(shí)，消化5和8 min的細(xì)胞所形成的克隆數(shù)極顯著高于消化2和11min的細(xì)胞(P<0.01)。 3．比較了不同濃度組合的地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C對(duì)ES細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響，結(jié)果顯示：在1×10<'-7>mol/L地塞米松、0.01 mol/Lβ-甘油磷酸鈉和0.05 g/L維生素C的作用下，細(xì)胞的誘導(dǎo)分化率高于其他各組，可達(dá)72％。ES細(xì)胞誘導(dǎo)3 d后，細(xì)胞開始變形，呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，誘導(dǎo)9 d

4、以后，開始產(chǎn)生突起。誘導(dǎo)15 d后，細(xì)胞中出現(xiàn)顆粒狀礦化結(jié)節(jié)，并逐漸增大形成白色鈣化結(jié)節(jié)。誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行堿性磷酸酶染色鑒定和鈣結(jié)節(jié)Von Kossa's染色鑒定顯示細(xì)胞中有黑色顆粒和棕黑色礦化結(jié)節(jié)，SABC免疫組化染色鑒定顯示ES細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后呈陽性反應(yīng)。 4．通過RA可定向誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，甲苯胺藍(lán)特異性染色和免疫組化鑒定。實(shí)驗(yàn)中比較了單獨(dú)使用RA和IMBX以及兩者聯(lián)合使用的效果，結(jié)果顯示：在2×10<'-6>

5、mol/L RA的作用下，．ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化鋁可達(dá)84％。ES細(xì)胞在誘導(dǎo)48 h后，大多數(shù)單個(gè)ES細(xì)胞伸出突起，形成單一的多突起細(xì)胞：細(xì)胞集落也漸漸變得松散，集落之間由這些突起連接成較緊密的網(wǎng)狀。誘導(dǎo)4 d后，單個(gè)神經(jīng)元樣細(xì)胞呈樹枝狀突起，突起細(xì)長(zhǎng)。RA誘導(dǎo)7 d的細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞中的尼氏體，免疫組化法檢測(cè)誘導(dǎo)后的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白M(NFM)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)，顯示ES細(xì)胞被誘導(dǎo)后

6、細(xì)胞NSE和NF反應(yīng)為陽性、GFAP反應(yīng)為陰性。 5．地塞米松、胰島素和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)在聯(lián)合作用時(shí)可將ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞，油紅O特異性染色鑒定并通過RT-PCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞特異性基因PPAR．吖。結(jié)果顯示：在含1×10<'-6>mol/L地塞米松、5×10<'-4>mol/LIBMX和10 mg/L胰島素的誘導(dǎo)液和含10 mg/L胰島素的循環(huán)液的共同作用下，ES細(xì)胞在誘導(dǎo)2 d后，細(xì)胞中開始有脂滴