共培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞向軟骨細胞分化的初步研究.pdf

1、目的:探討軟骨共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)小鼠ES細胞向軟骨細胞分化的可行性。 方法:實驗使用兩種不同的小鼠胚胎干細胞(ES cell)細胞株(E7及R1)。在第一部分，綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的E7 ES細胞初步分化，得到第4天胚體(EB)。將EB消化為單個細胞后，同豬關(guān)節(jié)軟骨細胞按一定比例(1: 3)混合后接種于聚乳酸一聚經(jīng)基乙酸復(fù)合生物材料(PLGA)，經(jīng)短期體外培養(yǎng)后植入裸鼠皮下7周取材。對照組為單純EB細胞接種組。取材檢測標(biāo)本內(nèi)軟

2、骨形成情況及EB細胞的轉(zhuǎn)歸。實驗第二部分，分為休內(nèi)部分實驗及體外實驗部分。體內(nèi)實驗中，將R1 ES細胞第4天胚體(EB)消化得到的單個細胞，經(jīng)過流式細胞儀分選后得到Flk-1陽性細胞及Flk-1陰性細胞。實驗組為Flk-1陽性細胞同豬關(guān)節(jié)軟骨細胞按一定比例(1: 3)混合后接種于聚乳酸一經(jīng)基乙酸復(fù)合生物材料(PLGA), Flk-1陰性細胞及未分選細胞同豬軟骨細胞混合后植入作為對照組。取材后行連續(xù)切片，切片分別做1E染色、藏紅花染色、熒

3、光拍照、抗二型膠原(anti-human collagen 11)免疫熒光染色及抗小鼠主要組織相容性抗原(anti-mouseMHC)免疫熒光染色。前兩種染色主要是顯示標(biāo)本內(nèi)軟骨生成情況，后兩種染色主要顯示軟骨組織來源。體外實驗中，將分選后的Flk-1陽性細胞離心后形成小球(pellet)，分別用軟骨條件培養(yǎng)液及軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)4周。對照組為F1k-1陰性細胞及未分選細胞制作成小球，用同樣的方法培養(yǎng)4周。檢測方法包括HE染色及抗二型膠原(

4、anti-human collagen II)免疫熒光染色，檢測標(biāo)本內(nèi)軟骨生成情況。 結(jié)果：實驗第一部分的結(jié)果顯示：實驗組形成軟骨組織和畸胎瘤的混合體。甲苯胺藍染色、HE染色結(jié)果和熒光照片及anti-mouse MHC免疫熒光照片結(jié)果對照后顯示，標(biāo)本內(nèi)部分軟骨細胞由小鼠ES細胞分化而來。對照組單純EB細胞接種后形成畸胎瘤，很少有軟骨組織生成；實驗第二部分體內(nèi)實驗的結(jié)果顯示：實驗組Flk-1陽性細胞同軟骨細胞共培養(yǎng)，得到的標(biāo)本大

5、體觀為白色透明的軟骨組織。未見畸胎瘤形成。染色結(jié)果顯示，除了少量的成纖維樣細胞構(gòu)成的松散組織，標(biāo)本內(nèi)主要由軟骨組織構(gòu)成。anti-mouse MHC免疫熒光染色顯示，標(biāo)本內(nèi)部分軟骨細胞來自小鼠ES細胞。對照組F1k-1陰性細胞同軟骨細胞共培養(yǎng)，得到軟骨組織同畸胎瘤的混合體。標(biāo)本內(nèi)軟骨細胞少有anti-mouse MHC免疫熒光染色陽性。另外一對照組未分選細胞同軟骨細胞共培養(yǎng)，標(biāo)本大體觀為白色透明的軟骨組織，未見畸胎瘤形成。內(nèi)主要由軟骨組

6、織構(gòu)成，有少量軟骨細胞anti-mouse MHC免疫熒光染色陽性。第二部分的體外實驗顯示，F(xiàn)1k-1陽性細胞形成的小球，在軟骨條件培養(yǎng)液、或軟骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)作用下，分泌基質(zhì)旺盛，并形成軟骨陷窩結(jié)構(gòu)。Flk-1陰性細胞在相同的培養(yǎng)體系內(nèi)，形成雜亂的成纖維樣結(jié)構(gòu)。未分選的EB細胞形成軟骨樣結(jié)構(gòu)同成纖維樣結(jié)構(gòu)的混合體。 結(jié)論：軟骨細胞共培養(yǎng)體系，使用于E7細胞系時，雖然不能使小鼠EB細胞全部向軟骨細胞分化，但可以誘導(dǎo)部分EB細胞向