胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向腎臟細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）由于具備強(qiáng)大的自我更新及多向分化潛能等特性，可作為再生醫(yī)學(xué)中種子細(xì)胞的新來源，受到廣大學(xué)者的普遍關(guān)注。有關(guān)ESCs向腎細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究起步相對(duì)較晚，近年才見部分報(bào)道。體外研究表明，ESCs經(jīng)特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)可向一定類型的腎細(xì)胞分化；體內(nèi)研究表明，后腎細(xì)胞微環(huán)境在誘導(dǎo)ESCs向腎臟細(xì)胞分化過程中起重要作用。本研究通過體外共培養(yǎng)方式模擬后腎細(xì)胞微環(huán)境，探討

2、其對(duì)ESCs向腎細(xì)胞方向分化的誘導(dǎo)作用，為研究ESCs向腎系細(xì)胞分化提供新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，并為探索后腎細(xì)胞微環(huán)境中影響ESCs向腎系細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層傳代培養(yǎng)小鼠D3系ESCs，RT-PCR法鑒定多潛能標(biāo)志基因Oct4、Nanog和Sox2的表達(dá)。 2.通過懸滴法將ESCs制備成擬胚體（Embryoil Bodies，EBs），將EBs分為共培養(yǎng)組和自然

3、分化組。共培養(yǎng)組：通過Transwells系統(tǒng)將EBs與孕12.5天的胎鼠后腎細(xì)胞進(jìn)行間接接觸共培養(yǎng)；自然分化對(duì)照組：常規(guī)方法培養(yǎng)EBs，令其自然分化。 3.采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法觀察后腎細(xì)胞微環(huán)境對(duì)EBs表達(dá)腎小管細(xì)胞標(biāo)志物Pax2和腎足細(xì)胞標(biāo)志物WT1的影響。 4.采用RT-PCR方法觀察胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境對(duì)EBs表達(dá)腎臟發(fā)育相關(guān)基因（Pax2、WT1、GDNF、Emx2、BMP-7、Nephrin和KSP）

4、及腎祖細(xì)胞標(biāo)志CD24基因的影響。 結(jié)果： 1.ESCs在飼養(yǎng)層細(xì)胞上呈集落樣生長(zhǎng)，RT-PCR結(jié)果顯示其多潛能標(biāo)志基因Oct4、Sox2、Nanog強(qiáng)表達(dá)，說明用于本實(shí)驗(yàn)的ESCs處于未分化狀態(tài)。 2.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組EBs第3天即可見Pax2陽(yáng)性細(xì)胞，且隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Pax2陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，且可見部分陽(yáng)性細(xì)胞成簇排列，形態(tài)類似圓環(huán)狀，而自然分化組EBs于第7天見少數(shù)Pax2

5、陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，共培養(yǎng)組Pax2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于自然分化組（P<0.05）；共培養(yǎng)組EBs第3天即可見WT1陽(yáng)性細(xì)胞，且隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，WT1陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，而自然分化組EBs未見WT1陽(yáng)性細(xì)胞。表明間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)ESCs向腎小管細(xì)胞和腎足細(xì)胞分化。 3.RT-PCR結(jié)果顯示，與自然分化組比較，共培養(yǎng)早期，后腎細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)后腎發(fā)育早期基因（Pax2、WT1）、后腎發(fā)育中期基因

6、（Emx2、GDNF、BMP7）及腎祖細(xì)胞標(biāo)志CD24基因的表達(dá)，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，后腎發(fā)育晚期基因（Nephrin、KSP）的表達(dá)增強(qiáng)，而后腎發(fā)育早期基因（Pax2、WT1）及后腎發(fā)育中期基因（Emx2、GDNF、BMP7）的表達(dá)減弱。提示間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境可調(diào)控ESCs表達(dá)后腎發(fā)育相關(guān)基因。 結(jié)論： 間接接觸共培養(yǎng)方式模擬的胚胎后腎細(xì)胞微環(huán)境可誘導(dǎo)ESCs向腎系細(xì)胞分化，并可調(diào)控后腎發(fā)