體外定向誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化.pdf

1、目的：通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑，探討胚胎干細(xì)胞體外向血管平滑肌細(xì)胞分化的趨勢(shì)。觀察胚胎干細(xì)胞在體外不同條件下定向誘導(dǎo)分化血管平滑肌細(xì)胞的能力。 方法：實(shí)驗(yàn)于2006年8月至2007年2月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液病研究所完成。①動(dòng)物及細(xì)胞系：清潔級(jí)孕12.5天的昆明小白鼠1只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)；小鼠胚胎干細(xì)胞系129X/SvJ由美國(guó)ATCC提供。②實(shí)驗(yàn)方法：從12.5天的胎鼠中分離出原代胚胎成纖維細(xì)胞，當(dāng)原代

2、胚胎成纖維細(xì)胞傳至3～5代時(shí)，更換為含體積分?jǐn)?shù)為0.15胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，24小時(shí)后收集培養(yǎng)液，加入條件培養(yǎng)基。用其對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，傳代時(shí)用差速貼壁法分離去除已分化的胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)懸滴-懸浮培養(yǎng)，構(gòu)建擬胚體分化模型。設(shè)立3組，各組均置于0.1％明膠處理過(guò)的T25培養(yǎng)瓶中，每瓶加入50個(gè)擬胚體，均勻分布于培養(yǎng)瓶底，使擬胚體貼壁生長(zhǎng)。誘導(dǎo)組7～10天加入10-9mol/L全反式維甲酸和3μg/L轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B1，

3、10～21天加入20μg/L血小板源性生長(zhǎng)因子，血清對(duì)照組僅加入去生長(zhǎng)因子胎牛血清，全反式維甲酸組加入全反式維甲酸。誘導(dǎo)21天的擬胚體，用胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ聯(lián)合消化為單個(gè)細(xì)胞，再加入20μg/L血小板源性生長(zhǎng)因子繼續(xù)誘導(dǎo)7大。③實(shí)驗(yàn)評(píng)估：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞血管平滑肌肌動(dòng)蛋白、血管平滑肌肌球夤白重鏈基因的表達(dá)，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)血管平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)來(lái)鑒定細(xì)胞性質(zhì)。 結(jié)果：①胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)

4、及擬胚體誘導(dǎo)分化：胚胎干細(xì)胞在體外能自發(fā)形成擬胚體，經(jīng)過(guò)不同生長(zhǎng)因子的分階段聯(lián)合誘導(dǎo)，擬胚體周圍出現(xiàn)大量的梭形細(xì)胞。②RT-PCR檢測(cè)：擬胚體血管平滑肌肌動(dòng)蛋白和血管甲滑肌肌球蛋白重鏈基因均呈陽(yáng)性表達(dá)。⑧免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)：熒光顯微鏡下，羅丹明染色細(xì)胞漿呈紅色熒光，并可見(jiàn)肌絲結(jié)構(gòu)；DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。誘導(dǎo)組血管平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性率明顯高于血清對(duì)照組和全反式維甲酸組(P<0.01)。 結(jié)論：①在條件培養(yǎng)基無(wú)飼養(yǎng)層上可大量擴(kuò)