成熟心肌細胞對早期胚胎或胚胎干細胞定向分化誘導作用的研究.pdf

1、目的：擬證實成熟心肌細胞對早期胚胎或胚胎干細胞(ESCs)定向分化存在特殊的誘導作用，為建立一套簡單實用的胚胎干細胞移植技術提供理論依據。 方法：分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞，以DAPI(4'6-聯(lián)瞇-2-苯基吲哚)染核作為細胞標記。分別應用自然合籠及超排卵技術獲取昆明小鼠的早期胚胎(8～16細胞期胚)與心肌細胞及相關心肌微環(huán)境共培養(yǎng)；取昆明小鼠(3.5～4天)的囊胚培養(yǎng)后分離出ESCs，以1到2代的小鼠ESCs細胞團與心肌細胞

2、及心肌成纖維細胞共培養(yǎng)。錄像動態(tài)觀察早期胚胎或ESCs向心肌細胞分化的情況；分別于共培養(yǎng)后3、7、14天行肌鈣蛋白T(cTnT)、α-肌動蛋白(α-Actinin)免疫熒光染色檢測。 結果： (1)早期胚胎與心肌細胞或心肌成纖維細胞共培養(yǎng)時，可繼續(xù)發(fā)育分化，所分化出的細胞無cTnT表達。 (2)1代或2代的ESCs細胞和/或細胞團與心肌細胞共培養(yǎng)約7天左右出現節(jié)律搏動的心肌樣細胞；觀察至14天時，搏動頻率約為30

3、～50次/min。最好實驗批次，可計數到1/4以上的ESCs細胞和/或ESCs細胞團出現節(jié)律性搏動；ESCs細胞和/或細胞團與心肌細胞共培養(yǎng)并添加0.6％的DMSO時，節(jié)律搏動的心肌樣細胞分化率未見顯著提高。 (3)心肌細胞誘導組，記錄己搏動和未搏動ESCs誘導分化后的心肌樣細胞cTnT、α-Actin蛋白熒光染色陽性率為27％；ESCs與心肌成纖維細胞共培養(yǎng)后的成纖維細胞誘導組，分化的細胞cTnT、α-Actin蛋白熒光染色均

4、陰性；0.6％DMSO誘導組中約3％的分化細胞cTnT、α-Actin蛋白熒光染色陽性；DMSO聯(lián)合心肌細胞誘導組，其結果與心肌細胞誘導組相似。 結論： (1)心肌細胞和心肌成纖維細胞所提供的微環(huán)境有利于早期胚胎發(fā)育分化，分化出的細胞可以繼續(xù)發(fā)育增殖。但是，不能誘導出cTnT陽性表達的心肌樣細胞，考慮主要是滋養(yǎng)層細胞的分化影響了細胞間的直接接觸，導致誘導失敗。 (2)未經建系操作的ESCs可被誘導分化為節(jié)律搏動的