APJ基因在人胚胎干細胞定向心肌細胞分化過程中表達特征的實驗研究.pdf

1、第一部分:化學成分明確的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基定向誘導人胚胎干細胞分化為心肌細胞的實驗研究
　　研究目的:
　　以E8培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，ESCs），探索化學成分明確的 CDM3誘導分化培養(yǎng)基在人 ESCs定向心肌細胞分化中的作用及最佳細胞接種密度。
　　研究方法:
　　人ESCs細胞復蘇后傳代3次，接種至鋪有生長因子減量的Matrigel膠上，待細胞匯合度達90%

2、左右時，換用CDM3誘導分化培養(yǎng)基，誘導分化的d0-d2加入6umol/L CHIR99021，d3-d4加入2umol/L Wnt-59，之后單用CDM3培養(yǎng)基，直至開始出現(xiàn)跳動的心肌細胞，誘導分化過程中觀察細胞形態(tài)及跳動心肌細胞數(shù)量的變化。再分別以0.5×104、1×104、1.5×104、2×104個/cm2的接種密度分別進行誘導分化實驗，觀察不同接種密度ESCs定向心肌細胞誘導分化的效率。
　　研究結果:
　　誘導d

3、7開始出現(xiàn)跳動的細胞，跳動細胞數(shù)量d7-d16逐漸增加，d16達高峰。細胞免疫熒光結果顯示：跳動細胞心肌特異性標志物a-Actinin、cTNNT2表達陽性，并可見明顯的肌節(jié)及潤盤結構；ESCs接種密度為0.5×104個/ cm2時不能成功誘導為心肌細胞，接種密度為2×104個/cm2的誘導效率較密度為1×104、1.5×104個/cm2者低。
　　結論:
　　CDM3誘導分化培養(yǎng)基可以成功誘導人 ESCs定向分化為心肌細胞

4、，1-1.5×104個/cm2為誘導分化的最佳接種密度。
　　第二部分:人胚胎干細胞定向心肌分化過程中APJ表達特征的研究
　　研究目的:
　　人ESCs定向心肌分化過程中，以中胚層階段、心肌細胞起始分化階段、心肌細胞后分化階段為時間節(jié)點，探索APJ的表達特征。
　　研究方法:
　　經(jīng)單層培養(yǎng)后，應用化學成分明確的誘導分化培養(yǎng)基定向誘導人ESCs向心肌細胞分化，于中胚層階段（d2）、心肌細胞起始分化階段（d

5、3）、心肌細胞后分化階段(d7)分別進行細胞免疫熒光檢測，共聚焦顯微鏡觀察Brachyury T、mesp1、Nkx2.5與APJ的蛋白表達情況，實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）法檢測四種標志物mRNA的表達水平。
　　研究結果:
　　誘導d7開始出現(xiàn)跳動的細胞，跳動細胞數(shù)量d7-d16逐漸增加，d16達高峰。細胞免疫熒光結果顯示： APJ在 d2、d3、d7三個階段分別與階段特異性標志物Brachyury