人心臟干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的研究.pdf

1、研究背景
　　心肌梗死(MI)是引起缺血性心肌病(ICM)導(dǎo)致心力衰竭(HF)的主要病因之一。目前臨床上的治療主要包括藥物、介入、外科手術(shù)治療。藥物治療可以改善癥狀并降低冠心病風(fēng)險;早期介入治療可以開通閉塞血管降低心肌梗死的死亡率;外科冠脈搭橋治療可以改善閉塞血管遠(yuǎn)端心肌細(xì)胞的血液供應(yīng),改善癥狀。心臟移植治療可從根本上達(dá)到治療的目的,但存在免疫排除反應(yīng)、供體數(shù)量有限,費用昂貴等問題。然而對于心肌缺血梗死后細(xì)胞喪失的問題,目前常用的

2、臨床治療方法均無法解決,不能達(dá)到心臟細(xì)胞水平重建的要求。心臟干細(xì)胞(CardiacStemCells,CSCs)具有自我復(fù)制、克隆形成、多向分化潛能,具有定向分化為心臟細(xì)胞系趨勢,而自體心臟干細(xì)胞移植治療不存在倫理問題、無免疫排斥反應(yīng),是治療心肌梗死及缺血性心肌病理想的種子細(xì)胞。目前國內(nèi)外關(guān)于心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究較多,但大多數(shù)為動物實驗,且由于實驗方法不同誘導(dǎo)分化的效率也頗有差異。人心臟干細(xì)胞因其獨特的性能,具有更廣泛的臨

3、床應(yīng)用潛能,有望成為一種優(yōu)質(zhì)高效治療心血管疾病的種子細(xì)胞。
　　研究目的
　　1.研究人心臟干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特征。
　　2.探索人心臟干細(xì)胞的純化與鑒定方法。
　　3.探索5-AZA和AngII及聯(lián)合誘導(dǎo)人心臟干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化及提高分化率的方法。
　　研究方法
　　1.經(jīng)患者或家屬同意并簽署知情同意書后從心外科手術(shù)中獲取人心臟右心耳組織,經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化、接種培養(yǎng),待其融合達(dá)90％左右

4、后進(jìn)行傳代,選P2~P4細(xì)胞用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行表面標(biāo)志物CD117(c-kit)、CD31、CD45檢測。
　　2.P2~P8細(xì)胞與免疫熒光(PE)標(biāo)記的心臟干細(xì)胞抗體CD117(c-kit)結(jié)合后經(jīng)流式細(xì)胞儀無菌分選純化心臟干細(xì)胞,對無菌分選純化后的c-kit+CSCs進(jìn)行培養(yǎng)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光染色鑒定。
　　3.選取無菌分選純化后細(xì)胞融合90%左右的c-kit+CSCs進(jìn)行誘導(dǎo)、分化實驗。實驗隨機(jī)分為4組:①空

5、白對照組(Control組普通細(xì)胞培養(yǎng)液)、②5-AZA誘導(dǎo)組(10μmol/L)、③AngII誘導(dǎo)組(0.1μmol/L)、④5-AZA和AngII聯(lián)合誘導(dǎo)組(10μmol/L+0.1μmol/L)?？瞻讓φ战M更換普通細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng);5-AZA、AngII單獨誘導(dǎo)組誘導(dǎo)24h后棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,更換普通細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng);5-AZA和AngII聯(lián)合誘導(dǎo)組24h后棄去5-AZA誘導(dǎo)培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,更換AngII誘導(dǎo)培養(yǎng)

6、液,24h后PBS洗滌2次,更換普細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在96h、4W觀察細(xì)胞形態(tài)變化;4W后用免疫熒光染色、WesternBlotting測定心肌細(xì)胞特異性蛋白cTnI、Cx43的表達(dá);用流式細(xì)胞儀測定各組心肌細(xì)胞分化率。
　　研究結(jié)果
　　1.原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征:倒置相差顯微鏡下觀察,細(xì)胞10d左右貼壁,貼壁細(xì)胞大小不一,呈三角形、梭形、多角形。貼壁1W后細(xì)胞快速增殖,向四周呈集落樣生長,20d左右融合達(dá)到80%。

7、r>　　2.細(xì)胞表面標(biāo)志物流式細(xì)胞儀檢測:用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面CD117、CD31、CD45標(biāo)志物檢測,統(tǒng)計結(jié)果顯示:CD117陽性表達(dá)率為(26.4±7.52)%、CD31陽性表達(dá)率為(8.5±3.81)%、CD45陽性表達(dá)率為(1.85±0.51)%。
　　3.人心臟干細(xì)胞純化及免疫熒光染色鑒定:流式細(xì)胞儀無菌分選獲得純度約為98.5%的c-kit+CSCs。倒置相差顯微鏡下觀察純化的c-kit+CSCs,細(xì)胞24h內(nèi)均勻貼

8、壁,細(xì)胞體積較原代細(xì)胞小,形態(tài)相似,呈長梭形或短梭形,折光性強,經(jīng)7d左右停滯期后細(xì)胞快速擴(kuò)增,14d左右融合達(dá)80%。免疫熒光顯微鏡下觀察幾乎所有細(xì)胞有都表達(dá)紅色熒光(PE-CD117),細(xì)胞呈長梭形或短梭形,細(xì)胞核圓、居中。
　　4.人心臟干細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征:誘導(dǎo)96h后,Control組細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變,排列無規(guī)律性;5-AZA組細(xì)胞死亡脫落明顯,細(xì)胞近似梭形,以簇狀排列為主;AngII組細(xì)胞近似梭形,以條梭狀排

9、列為主;AngII和5-AZA聯(lián)合組細(xì)胞少量死亡脫落,細(xì)胞近似梭形,排列呈以簇狀或條索狀。4W后Control組:細(xì)胞體積大小不均一,呈長梭狀或短梭狀、多角形等,少數(shù)細(xì)胞形態(tài)較誘導(dǎo)前變長,無明顯排列規(guī)律;各誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)均變長,以梭形細(xì)胞為主,排列呈束狀,5-AZA和AngII聯(lián)合組細(xì)胞形態(tài)、排列變化最為顯著。
　　5.人心臟干細(xì)胞誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞特異性蛋白cTnI、Cx43測定:誘導(dǎo)4W后免疫熒光、Westernblotting結(jié)

10、果顯示,四組細(xì)胞中均有cTnI、Cx43表達(dá),Control組表達(dá)最弱,5-AZA和AngII聯(lián)合組表達(dá)最強。統(tǒng)計結(jié)果顯示:5-AZA組、5-AZA和AngII聯(lián)合組表達(dá)高于Control組,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);5-AZA和AngII聯(lián)合組表達(dá)高于AngII組,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);5-AZA和AngII聯(lián)合組表達(dá)高于5-AZA組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);5-AZA組表達(dá)高于AngII組,有計學(xué)差異(P<

11、0.05);AngII組高于Control組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　6.人心臟干細(xì)胞誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞分化率測定:誘導(dǎo)4W后流式細(xì)胞儀分析各組心肌細(xì)胞分化率,統(tǒng)計結(jié)果顯示:Control組(28.86±4.62)%、5-AZA組(53.71±7.5)%、AngII組(41.48±7.12)%、5-AZA和AngII聯(lián)合組(65.74±6.21)%;四組間見均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);5-AZA組、5-AZA和AngI

12、I聯(lián)合組高于Control組,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
　　研究結(jié)論
　　1.采用酶消化法可以從人右心耳組織中分離培養(yǎng)出人心臟干細(xì)胞。
　　2.通過流式細(xì)胞儀無菌分選純化獲得高純度的c-kit+CSCs,人c-kit+CSCs在心臟干細(xì)胞培養(yǎng)液中可以快速生長增殖。
　　3.人c-kit+CSCs能夠在普通細(xì)胞培養(yǎng)液中向心肌細(xì)胞分化,具有自我分化可能性,但速度較慢。
　　4.5-AZA、AngII均