脂肪干細胞增殖特性及向心肌細胞分化的研究.pdf

1、目前心肌梗死仍是發(fā)病率和死亡率較高的疾病之一。由于心肌細胞再生能力有限，壞死的心肌組織即使得到再灌注治療也只能由無收縮功能的瘢痕組織替代，細胞移植治療只能修復(fù)小面積心肌損傷，而組織工程技術(shù)為大面積心肌缺損提供了一個較好的治療方法。組織工程包括種子細胞、支架材料和生物活性分子三大要素。
　　 干細胞由于具有自我更新和多向分化潛能將成為重要的組織工程種子細胞，但由于胚胎干細胞、骨髓干細胞以及誘導(dǎo)的多潛能干細胞存在著倫理道德或免疫排斥

2、反應(yīng)，甚至有致瘤的危險性，而脂肪干細胞由于來源簡便充足，容易大量提取獲得，移植后無免疫排斥反應(yīng)，將成為組織工程比較有前景的種子細胞。因此我們用改進的方法分離培養(yǎng)脂肪干細胞，并對其增殖能力和多向分化潛能進行檢測。通過胰酶和膠原酶聯(lián)合分次消化和換液去除紅細胞，我們改進了脂肪干細胞的分離方法，可從400～600mg脂肪組織收獲約5X105個脂肪組織來源的干細胞，并且細胞可以重疊生長一個月以上，期間細胞表現(xiàn)出幾個對數(shù)增殖期；所有增殖的細胞其干細

3、胞相關(guān)表面標記(CD13，CD29，CD44，CD105和CD166)都呈陽性表達；多潛能細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Nanog，Oct-4，Sox-2和Rex-1也呈強陽性表達；通過油紅、甲苯胺蘭、ALP、von Kossa及熒光染色證明脂肪組織來源的干細胞具有向多個胚層細胞分化的能力。此外，為獲得更多具有強增殖能力的細胞，根據(jù)生長曲線，我們對細胞進行每14天傳代而非常規(guī)的5天傳代，發(fā)現(xiàn)所得到的細胞仍保持強的增殖能力、干細胞表型以及更強的多向分化

4、潛能。
　　 制備適于種子細胞生長的支架材料也是構(gòu)建工程化組織的關(guān)鍵。在各種生物材料中，天然生物材料膠原和殼聚糖都具有較好的生物相容性和生物可降解性，但膠原的機械強度差，而殼聚糖由于其晶體結(jié)構(gòu)而較堅硬，因此結(jié)合膠原和殼聚糖來制備支架將可避免兩種材料的缺點，從而制備出適于種子細胞生長的支架。我們采用凍干法制備不同比例的膠原一殼聚糖支架，研究支架的孔徑、孔隙率、保水性、生物可降解性以及與脂肪干細胞的生物相容性。凍干后的支架內(nèi)部呈海綿

5、狀多孔隙結(jié)構(gòu)，其中以膠原/殼聚糖體積比為9:1的復(fù)合支架最為疏松，1:9的支架最致密。掃描電鏡下支架的膠原含量越高，支架內(nèi)的膠原絲越多，支架的孔與孔之間相互連通構(gòu)成了通孔。交聯(lián)前后支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯改變。交聯(lián)后體積比為9:1，7:3和5:5的復(fù)合支架孔徑為50～200μm之間，可用于細胞的三維培養(yǎng)。體積比為5:5的復(fù)合支架的吸水性和含水量最高，7:3和3:7次之；多孔支架在水中未發(fā)生明顯的溶脹現(xiàn)象；支架的孔隙率均在90％以上。交聯(lián)后隨

6、著膠原含量的減少，降解速率減慢，交聯(lián)后的復(fù)合支架降解速度較未交聯(lián)慢。脂肪干細胞在支架上培養(yǎng)5d后掃描電鏡和HE染色可見細胞在7:3的支架上爬行生長并融合成片，而5:5支架上黏附生長的細胞較少。
　　 組織工程構(gòu)建過程中，提供適于種子細胞生長的微環(huán)境也是很重要的，體外細胞生長的環(huán)境要盡量模擬體內(nèi)的三維動態(tài)微環(huán)境，而轉(zhuǎn)瓶生物反應(yīng)器可提供三維動態(tài)微環(huán)境，促進懸浮和貼壁細胞的增殖和分化。因此我們利用轉(zhuǎn)瓶生物反應(yīng)器提供三維動態(tài)微環(huán)境，對支

7、架內(nèi)的脂肪干細胞進行擴增，并檢測擴增后干細胞的表型特性及多向分化潛能。脂肪干細胞在轉(zhuǎn)瓶生物反應(yīng)器中擴增14天后，與靜態(tài)條件下相比，支架內(nèi)的細胞具有更強的增殖活性，擴增倍數(shù)大約為26倍，而靜態(tài)條件下細胞擴增倍數(shù)近20倍；所擴增的細胞能夠保持原有的干細胞表型特性和多向分化潛能。
　　 局部微環(huán)境在干細胞的定向分化中起著決定性作用，而心肌樣微環(huán)境可促進骨髓干細胞向心肌細胞分化，因此心肌樣微環(huán)境也可能促進脂肪干細胞向心肌細胞分化。我們分

8、別對脂肪干細胞和心肌細胞進行間接和直接共培養(yǎng)研究，并檢測共培養(yǎng)后脂肪干細胞超微結(jié)構(gòu)的變化以及心肌特異性蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的表達。經(jīng)2周共培養(yǎng)后，分化的脂肪干細胞呈現(xiàn)心肌樣超微結(jié)構(gòu)，并表達心肌特異性蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，流式細胞儀分析結(jié)果顯示，間接共培養(yǎng)2周后約20％的細胞表達心肌特異性蛋白，而直接共培養(yǎng)2周后約30～40％的細胞表達心肌特異性蛋白，并且直接共培養(yǎng)體系中分化的脂肪干細胞的心肌特異性蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的表達率明顯高于間接共培養(yǎng)體系中的表達

9、率。
　　 在各種生長因子中，人胰島素樣生長因子(IGF-1)在心臟發(fā)生和發(fā)育過程中起著重要的作用，能促進早期心肌分化。因此我們利用IGF-1基因作為目的基因，整合到支架內(nèi)并轉(zhuǎn)染脂肪干細胞，應(yīng)用心肌細胞培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)瓶生物反應(yīng)器提供三維動態(tài)微環(huán)境，研究脂肪干細胞在膠原.殼聚糖支架內(nèi)向心肌細胞分化的情況。結(jié)果顯示動態(tài)微環(huán)境能促進質(zhì)粒DNA的釋放和轉(zhuǎn)染；IGF-1可促進脂肪干細胞在膠原-殼聚糖支架內(nèi)增殖以及向心肌細胞分化；

10、動態(tài)微環(huán)境可加強IGF-1的促進脂肪干細胞增殖分化作用。
　　 本研究采用改進的方法可較容易的獲得大量脂肪干細胞，并發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞具有較強的增殖能力和多向分化潛能；所制備的膠原-殼聚糖多孔支架具有較好生物相容性和生物可降解性，適于脂肪干細胞的三維培養(yǎng)；所設(shè)計的支架一轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)是一個簡便有效的擴增脂肪干細胞的方法；心肌樣微環(huán)境可促進脂肪干細胞向心肌細胞分化；將細胞生長的支架內(nèi)的陽離子多聚物作為IGF-1基因轉(zhuǎn)染的載體，這種轉(zhuǎn)染方