胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中內(nèi)皮細(xì)胞的作用.pdf

1、研究背景和目的:在缺血性心臟疾病中，細(xì)胞移植治療具有廣闊的前景，而具有多項分化潛能的胚胎干細(xì)胞作為一種具有治療作用的組織，擁有巨大的臨床應(yīng)用潛力。最近，很多研究都指出胚胎干細(xì)胞來源的內(nèi)皮細(xì)胞對于缺血性心臟疾病可能有治療作用。眾所周知，心肌細(xì)胞生活在血管系統(tǒng)微環(huán)境中，心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在發(fā)育過程中，幾乎同時從生心中胚層中產(chǎn)生，但迄今為止，沒有直接證據(jù)證明兩者在胚胎干細(xì)胞分化過程中有著功能性的聯(lián)系。本研究通過添加外源性內(nèi)皮細(xì)胞和抑制內(nèi)源性內(nèi)

2、皮細(xì)胞的方法，觀察胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化這一過程的變化，從而為胚胎干細(xì)胞分化過程中這兩種細(xì)胞之間的關(guān)系提供直接的證據(jù)，為今后內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用于臨床心臟疾病提供細(xì)胞學(xué)方面的依據(jù)。 方法：采用常規(guī)懸滴培養(yǎng)分化的方法，借助CGR8-GFP這一熒光蛋白檢測小鼠胚胎干細(xì)胞系心肌特異性的肌球蛋白重鏈（α－MHC）的表達(dá)情況觀察胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程。第一個實驗是添加入不同數(shù)量的外源性內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，觀察胚胎干細(xì)胞分化所得心肌細(xì)胞數(shù)

3、量的變化。第二個實驗是添加內(nèi)皮細(xì)胞特異性抑制劑－Endostatin，觀察當(dāng)內(nèi)源性內(nèi)皮細(xì)胞被抑制后，胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞數(shù)量的變化。第三個實驗是在添加內(nèi)皮細(xì)胞特異性抑制劑Endostatin的基礎(chǔ)上，再次加入不同數(shù)量的外源性內(nèi)皮細(xì)胞，觀察胚胎干細(xì)胞分化所得心肌細(xì)胞數(shù)量的變化。 結(jié)果： 1、在胚胎干細(xì)胞的分化過程中，相比加入外源性成纖維細(xì)胞（NIH3T3，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞－MEFs），加入外源性內(nèi)皮細(xì)胞（人類骨髓微血

4、管內(nèi)皮細(xì)胞－BMECs，人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞－ HUVECs）后，心肌細(xì)胞形成明顯增多。BMECs的作用相對比較穩(wěn)定，但存在細(xì)胞數(shù)量依賴效應(yīng)：200個BMECs，是早期獲得大量心肌細(xì)胞的最少外源性內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。 2、當(dāng)使用特異性內(nèi)皮細(xì)胞抑制劑－Endostatin時，在內(nèi)源性內(nèi)皮細(xì)胞被抑制的同時，心肌細(xì)胞的形成也明顯減少。Endostatin存在劑量依賴效應(yīng)，2ug/ml能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞。第0天加入endostatin

5、，第10天或者第15天收集分化的擬胚體，無論是心肌細(xì)胞還是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物，在基因水平和蛋白質(zhì)水平表達(dá)都明顯下調(diào)。 3、外源性內(nèi)皮細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的共培養(yǎng)能夠挽救由于內(nèi)源性內(nèi)皮細(xì)胞抑制（由Endostatin所介導(dǎo)）而導(dǎo)致的心肌細(xì)胞形成障礙。在分化的第9天，在添加200個外源性內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）的組中，無論是否添加endostatin，都出現(xiàn)了跳動的心肌細(xì)胞團(tuán)，在每組72個擬胚體中，加入endostatin組出現(xiàn)了9個（12