小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)及nesprins在此分化過程中的表達(dá).pdf

1、第一部分：小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn) 目的：探索提高胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。 方法： 1.制備原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryo fibroblasts，MEF）飼養(yǎng)層。 2.復(fù)蘇129系小鼠ESC至飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞均勻鋪滿六孔板底部80％左右，即可按一定比例傳代或凍存。 3.取未分化的ESC，分別

2、采用懸滴-懸浮-貼壁三步法（懸滴三步法）和懸浮-貼壁兩步法（懸浮兩步法），按誘導(dǎo)劑的不同分為Ⅰ組：丹參+5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）組；Ⅱ組：丹參+維甲酸（retinoic acid，RA）組；Ⅲ組：5-aza；Ⅳ組：丹參組；Ⅴ組：RA組；Ⅵ組：陰性對(duì)照組6組進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，比較在2種培養(yǎng)方法下各組心肌細(xì)胞的分化率。 4.采用RT-PCR檢測(cè)ESC時(shí)期、培養(yǎng)d7、d7+9的細(xì)胞α-MHC和MLC-2v基因

3、mRNA的表達(dá)。 5.采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)培養(yǎng)d7+9具有自發(fā)搏動(dòng)的擬胚體（embryoid bodies，EBs）心肌蛋白α輔肌動(dòng)蛋白（α-actinin）、肌球蛋白（myosin）、肌動(dòng)蛋白（α-actin）的表達(dá)。 結(jié)果： 1.MEF細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，排列緊密成短梭形。制備的飼養(yǎng)層可用7～10d。 2.生長(zhǎng)在MEF上的ESC呈集落狀，顯微鏡下折光性強(qiáng)，細(xì)胞間緊密堆積，細(xì)胞界限不清。經(jīng)過懸滴三步法和懸

4、浮兩步法培養(yǎng)后形成的聚集物即EBs成立體球狀結(jié)構(gòu)。倒置相差顯微鏡下觀察加入誘導(dǎo)劑第2d（即d7+2）可見自發(fā)性收縮，1個(gè)EB可有1個(gè)或多個(gè)收縮中心。 3.Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ組采用懸滴三步法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分化率分別為（77.78±5.09）％，（66.67±8.82）％，（51.11±1.92）％，（44.44±5.09）％，（23.33±3.34）％；采用懸浮兩步法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分化率分別為（42.22±6.94）％，（36.6

5、7±8.82）％，（25.55±10.71）％，（17.78±5.09）％，（10.00±2.84）％。各組心肌細(xì)胞分化率懸滴三步法較同組懸浮兩步法高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。采用懸滴三步法培養(yǎng)Ⅰ組心肌細(xì)胞分化率最高，與其它各組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 4.RT-PCR結(jié)果顯示心肌特異性基因α-MHC在d7開始表達(dá)，心室肌特異基因MLC-2v在d7+9有表達(dá)。 5.免疫細(xì)胞化學(xué)示心肌特異性結(jié)構(gòu)

6、蛋白α-actinin、myosin、α-actin均成陽性表達(dá)。 結(jié)論：懸滴三步法聯(lián)合采用中藥丹參與5-aza為誘導(dǎo)劑，可提高體外ESC分化為心肌細(xì)胞的分化率。 第二部分：Nesprins基因在小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中的表達(dá) 目的：研究nesprins基因在小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）分化為心肌細(xì)胞過程中的表達(dá)，探討nesprins基因在心肌細(xì)胞發(fā)育過程中的作用。

7、 方法： 1.體外培養(yǎng)小鼠ESC，采用懸滴-懸浮-貼壁三步法（懸滴三步法），以5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）為誘導(dǎo)劑促ESC分化為心肌細(xì)胞。 2.采用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定心肌細(xì)胞。 3.采用RT-PCR檢測(cè)ESC時(shí)期、培養(yǎng)d7、d7+3、d7+6、d7+9、d7+20的細(xì)胞nesprin-1、nesprin-2基因mRNA的表達(dá)。 4.采用免疫熒光檢測(cè)ESC時(shí)期

8、、培養(yǎng)d7、d7+3、d7+6、d7+9、d7+20各時(shí)間點(diǎn)nesprin-1蛋白在細(xì)胞中的定位。 結(jié)果： 1.生長(zhǎng)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的ESC呈集落狀，相差倒置顯微鏡下折光性強(qiáng)，細(xì)胞間緊密堆積，細(xì)胞界限不清。經(jīng)過懸滴三步法培養(yǎng)后形成的擬胚體（embryoid bodies，EBs）成立體球狀結(jié)構(gòu)。以5-aza為誘導(dǎo)劑在分化d7+2可見自發(fā)性收縮，1個(gè)EB可有1個(gè)或多個(gè)收縮中心。 2.RT-PCR結(jié)果顯示

9、心肌特異性基因α-MHC在d7開始表達(dá)，心室肌特異基因MLC-2v在d7+9有表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)示心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白α-輔肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白均成陽性表達(dá)。 3.Nesprin-1、nesprin-2基因mRNA在ESC分化為心肌細(xì)胞過程中均有表達(dá)且呈動(dòng)態(tài)變化；Nesprin-1基因mRNA在ESC培養(yǎng)到d7+6時(shí)期表達(dá)逐漸增高，隨后呈下降趨勢(shì)，在d7+20時(shí)表達(dá)最低（P<0.05）；Nesprin-2基因mRNA在培養(yǎng)