Brachyury在小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞中的作用.pdf

1、小鼠胚胎干細胞（mESCs）來源于胚胎著床前的多能干細胞，能夠在體外持續(xù)培養(yǎng)并保持自我更新的能力，同時又具有多向分化的潛能，可以分化成機體的各種細胞類型。目前己經在發(fā)育分化模型的構建中起到不可或缺的作用，同時廣泛的用于再生醫(yī)學的研究及細胞學移植的研究。
　　經典的Wnt/β-catenin信號通路在胚胎的發(fā)育以及多種干細胞的分化中起著關鍵的作用。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在胚胎時期心臟的發(fā)育以及血管形成等過程中起

2、到了不可或缺的作用，在胚胎干細胞分化過程的特定的時間段激活該信號通路可誘導胚胎干細胞定向分化成心肌細胞。Brachyury（T）基因是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，也是中胚層的標志基因，在胚胎發(fā)育中胚層形成的過程中高度表達。
　　為了研究T基因在mESCs分化過程中的作用，我們通過PB（PiggyBac）質粒過表達該基因，將構建好過表達質粒后轉染到mESCs中，采用LIF/serum培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用細胞計數(shù)的方法

3、檢測過表達T基因后細胞的增殖情況，并用堿性磷酸酶染色（AP染色）方法檢測mESCs的分化情況。分化實驗是采用單個細胞懸浮培養(yǎng)的方法首先形成擬胚體(EBs)，形成的EBs可形成三個胚層，其中中胚層可進一步分化形成心肌細胞。研究報道，單獨使用GSK3β抑制劑BIO可以誘導胚胎干細胞分化成心肌細胞。我們研究表明在mESCs分化早期階段加入GSK3β抑制劑CHIR99021(CHIR)可以促進胚胎干細胞向心肌細胞分化，實驗時我們加入CHIR作為

4、陽性對照組。研究結果表明，過表達T基因后細胞的增殖慢于對照組，且細胞的分化傾向增加且更易于分化。分化實驗的qRT-PCR結果表明，三組隨著分化時間的增加心肌標志基因cTnT、Cx43、Nkx2.5、和α-MHC的表達量增加，其中過表達T基因的T組表達量高于陰性對照PB組，而低于陽性對照CH組。Western blot結果顯示第10天T組的Cx43和α-MHC蛋白的表達量高于PB組而低于CH組，第15天的蛋白表達量趨勢與第10天一樣，但各

5、組相應的蛋白表達量高于第10天的表達量。免疫熒光染色結果與Western blot結果趨勢一樣即三組中α-MHC和Cx43蛋白免疫熒光均陽性，T組熒光強于PB組，CH組熒光強于T組。因此，過表達T基因可促進mESCs向心肌細胞分化，分化效率弱于GSK3β抑制劑CHIR的誘導效率。
　　為了進一步研究T基因的促進mESCs心肌細胞的分化作用，我們采用慢病毒pLKO.1質粒系統(tǒng)敲低該基因，將重組質粒用相同的方法轉染到mESCs中，采用

6、LIF/serum培養(yǎng)基培養(yǎng)，用懸浮培養(yǎng)方法形成EBs。用qRT-PCR檢測心肌標志基因的表達情況，用Western blot檢測心肌標志蛋白。實驗結果表明三組隨著分化時間的增加心肌標志基因cTnT、Cx43、Nkx2.5和α-MHC的表達量增加，其中敲低組的表達量低于對照組。Western blot結果顯示第10天敲低組的Cx43和α-MHC蛋白的表達量低于對照組，第15天的蛋白表達量趨勢與第10天一樣，但各組相應的蛋白表達量高于第1