小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的丟失、變性或壞死均可導(dǎo)致一系列視網(wǎng)膜變性疾病，包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)，老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)，先天性黑朦(Lebers congenital amaurosis,LCA)和視錐-視桿細(xì)胞營養(yǎng)不良(cone-rod dystrop

2、hy, CORD)等疾病。目前，國內(nèi)外尚無該類嚴(yán)重性致盲性疾病的有效治療手段。關(guān)于干細(xì)胞替代性治療視網(wǎng)膜變性疾病的可行性和有效性，近年來成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）具有分化的多潛能性，來源穩(wěn)定且能在體外大量擴(kuò)增，使其成為治療視網(wǎng)膜變性疾病的一個(gè)研究熱點(diǎn)，為視網(wǎng)膜變性疾病提供一種全新的治療模式，為有效治療嚴(yán)重致盲性眼部疾病帶來了希望。研究發(fā)現(xiàn)，在一定的培養(yǎng)條件下，ESCs能被誘導(dǎo)

3、分化為神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞和肝細(xì)胞等，涵括了內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的所有細(xì)胞和組織，包括RPE細(xì)胞和光感受器細(xì)胞。因此， ESCs誘導(dǎo)為眼治療細(xì)胞，將成為治療嚴(yán)重致盲性眼部疾病的一種新途徑。
　　迄今為止，ESC向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞（retinal progenitor cells,RPCs）分化的主要方法有自然分化法，基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)（stromal cell-derived inducing activity,SD

4、 IA）培養(yǎng)法，無血清的擬胚體（serum-free embryoid body–like，SFEB）培養(yǎng)法和改良的SFEB/DLFA培養(yǎng)法。研究發(fā)現(xiàn)，ESCs具有分化為內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的所有細(xì)胞和組織的能力，在不添加任何誘導(dǎo)劑的情況下，約有1％的ESCs自發(fā)分化為RPE細(xì)胞，該方法耗費(fèi)時(shí)間長（42天-56天）且目的細(xì)胞生成率低；Kawa saki H等將小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells，mESCs

5、)與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后成功誘導(dǎo)出神經(jīng)元，此種方法稱為SDIA培養(yǎng)法，該方法誘導(dǎo)出的神經(jīng)元大多數(shù)為中腦多巴胺能神經(jīng)元，SDIA法尚未誘導(dǎo)出光感受器細(xì)胞，而且mES Cs與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)容易出現(xiàn)污染；2005年Ikeda等用SFEB法成功誘導(dǎo)出Rax+/Pax6+的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞（Retinal progenitor cells, RPCs）,與SDIA法相比，SFEB法成功誘導(dǎo)出RPCs，且RPCs生成效率高（＞50%），與自然分化法相比誘導(dǎo)

6、分化時(shí)間至少縮短25天，但SFEB法必須與胚胎視網(wǎng)膜共培養(yǎng)才能得到成熟的光感受器細(xì)胞；在SFEB法的基礎(chǔ)上，Osakada等人采用改良的SFEB/DLFA法，在誘導(dǎo)分化的特定時(shí)間點(diǎn)加入γ-促分泌酶抑制劑(N-[N-(3,5- Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-2-phenylglycine tert-butylester,DAPT)，酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acid fibro-blast growth fac

7、tor，aFGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibro-blast growt h factor，bFGF），視磺酸（retinoic acid，RA）等小分子誘導(dǎo)劑，成功誘導(dǎo)出RPE細(xì)胞和成熟光感受器細(xì)胞，與SFEB/DLFA法相比，不僅提高了ESCs向RPCs的分化效率，并避免與胚胎視網(wǎng)膜共培養(yǎng)的過程。
　　基于上述研究成果，本實(shí)驗(yàn)采用改良的SFEB/DLFA法將mESC定向誘導(dǎo)分化為RPCs，通過應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光

8、和流式細(xì)胞技術(shù)對 RPCs的特異性標(biāo)記物Pax6、Sox2和Otx2進(jìn)行鑒定，檢測三者在mESC分化為RPCs過程中的基因表達(dá)，為進(jìn)一步研究mESC向成熟光感受器細(xì)胞分化提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分：
　　第一部分：mESCs的培養(yǎng)與鑒定
　　第二部分：mESCs誘導(dǎo)分化為RPCs的培養(yǎng)與鑒定
　　第三部分：小鼠RPCs分化發(fā)育過程中基因表達(dá)
　　目的：
　　1．對V6.5小鼠ESCs進(jìn)行體外培養(yǎng)及擴(kuò)增，并

9、鑒定該株小鼠胚胎干細(xì)胞的干性和增殖能力。
　　2．探討mESCs定向誘導(dǎo)分化為RPCs的體外培養(yǎng)方法。
　　3．研究RPCs分化發(fā)育過程中Pax6、Sox2和Otx2基因的表達(dá)。
　　方法：
　　本研究采用mESCs（V6.5細(xì)胞株），使其穩(wěn)定傳代擴(kuò)增，用細(xì)胞免疫熒光染色法和流式細(xì)胞技術(shù)對mESCs進(jìn)行mESCs標(biāo)記物階段特異性胚胎抗原1(stage sp ecific embryonic antigen1,SS

10、EA1)、增殖能力（Ki67）、細(xì)胞周期和堿性磷酸酶( alkaline phosphatase,AKP)的鑒定，在無血清條件下將mESCs懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(embryoid bodies,EBs)，并在培養(yǎng)基中添加抑制因子1（Dicckopf-1,DKK1）、L efty-A和γ-促分泌酶抑制劑（N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-2- phenylgly cine tert-butyl

11、ester,DAPT）等將mESCs誘導(dǎo)分化為RPCs，在分化的第0天,第10天和第20天，分別進(jìn)行RPCs發(fā)育過程中Pax6、Sox2和Otx2的基因表達(dá)、增殖能力和細(xì)胞周期的檢測。
　　結(jié)果：
　　1．mESCs生長良好，能在體外大量擴(kuò)增，細(xì)胞免疫熒光染色和流式細(xì)胞技術(shù)鑒定增殖能力標(biāo)記物 Ki67和細(xì)胞周期顯示 Ki67陽性表達(dá)，細(xì)胞周期檢測mESC G2+S=(81.93±1.32)%，提示該株mESC狀態(tài)良好，增殖活

12、躍。
　　2．成功地定向誘導(dǎo)分化為RPCs, RPCs特異性標(biāo)記物Pax6、Sox2和Otx2呈陽性表達(dá)，流式細(xì)胞檢測分化第20天，Pax6、Sox2和Otx2陽性表達(dá)率分別為(50.87±2.97)%、(49.10±2.6)%和(32.01±3.87)%，Ki67和細(xì)胞周期檢測均顯示誘導(dǎo)分化第20天的RPCs仍具有一定的增殖能力。
　　3．在mESCs向RPCs發(fā)育分化過程中，細(xì)胞免疫熒光染色顯示第5、10、20天的Pax

13、6、Sox2和Otx2均表達(dá)陽性，流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Pax6和Sox2呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，并在第10天達(dá)到高峰值，分別為(77.30±2.50)%和(91.89±1.50)%；Otx2表達(dá)逐漸升高，第20天達(dá)到(32.01±3.87)%。
　　結(jié)論：
　　1．mESCs在體外培養(yǎng)，能保持其胚胎干細(xì)胞的干性和自我增殖能力，可用于下一步定向誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)。
　　2．在特定的誘導(dǎo)因子作用下，mESCs可定向誘導(dǎo)分化為R