體外誘導胚胎干細胞分化為汗腺細胞的初步研究.pdf

1、目的:探討體外定向誘導小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)分化為汗腺細胞的條件，為汗腺修復機制的研究奠定基礎(chǔ)。 方法:1．小鼠胚胎干細胞的體外分離、培養(yǎng)、傳代和鑒定取12.5～14.5胎齡的胎鼠去除頭、尾、四肢后，剪碎組織塊胰蛋白酶消化，離心去上清即分離獲得原代成纖維細胞，培養(yǎng)3d后傳代。采用20μg/mL絲裂霉素C處理胚鼠成纖維細胞2～4h后制備出胚胎干細胞的滋養(yǎng)層細胞。取BALB/C小鼠3.5d囊

2、胚，接種于滋養(yǎng)層細胞上，培養(yǎng)5～6d后挑取胚胎干細胞集落，胰酶消化傳代。觀察細胞集落生長情況，堿性磷酸酶染色、細胞核型分析等對細胞進行鑒定。2．人汗腺細胞的體外分離、培養(yǎng)、傳代和鑒定：取患者腹部全層皮膚，剪碎后膠原酶消化，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后在清潔的、紫外線消毒的50×倒置顯微鏡下用40μl微量移液器吸取汗腺腺體于另一盛有Hank’s的培養(yǎng)皿中，待汗腺貼壁后，補加約2ml汗腺培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2～3d換液，待汗腺細胞約80％融合后

3、，按1：2傳代培養(yǎng)。用免疫細胞化學染色法檢測汗腺細胞內(nèi)CK19和CEA的表達。3．誘導ES細胞的實驗分組：條件培養(yǎng)基組為含30％汗腺細胞勻漿液的條件培養(yǎng)基誘導ES細胞4h后被去除，再加入誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)；對照組為只加誘導培養(yǎng)基。兩組細胞誘導14天后，免疫組織化學染色法檢測誘導后的細胞內(nèi)CK19和CEA的表達。流式細胞學檢測誘導后兩組中表達CK19和CEA的陽性細胞率。 結(jié)果:1．ES細胞呈集落性生長；堿性磷酸酶組織化學染色陽性；具

4、有正常核型。2．可見上皮細胞從腺體中爬出，呈多邊形，持續(xù)分裂，在原來單層基礎(chǔ)上繼續(xù)生長為多層，如“鋪路石”樣，相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的汗腺為混合形態(tài)的上皮細胞。3．免疫組織化學染色結(jié)果顯示，條件培養(yǎng)基組細胞表達CK19和CEA均為陽性；流式細胞學檢測，條件培養(yǎng)基組ESCs中CKl9陽性率為10.44％，CEA陽性率為6.33％，較對照組CK19陽性率1.38％，CEA陽性率1.49％明顯升高(p≤0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。