小鼠孤雌胚胎干細胞直接向神經(jīng)細胞誘導(dǎo)分化的實驗研究.pdf

1、胚胎干細胞(embryonicst emc ell,ES)是一種從哺乳動物囊胚中獲得的全能細胞。胚胎干細胞能在體外特定條件下無限地自我更新并能分化成體內(nèi)任何一種細胞，因此它在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和臨床治療領(lǐng)域都有重要的研究價值。神經(jīng)退行性疾病(如帕金森，老年性癡呆等)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如中風(fēng)，腦缺血，脊髓損傷等)是多發(fā)性疾病。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞(neural Stem Cells，NSCs)移植可以替代死亡或退變的神經(jīng)元，移植后可明顯改善上述疾

2、病的臨床癥狀，這一成果對神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退行性疾病的治療具有劃時代的意義。因此，ES細胞向神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化目前成為科學(xué)研究的熱點。胚胎干細胞有四種來源：一是從正常受精卵形成的囊胚中獲得；二是從早期胚胎生殖嵴中獲得；三是從核轉(zhuǎn)移途徑得到的囊胚中獲得；四是從孤雌生殖形成的囊胚中獲得。第四種途徑產(chǎn)生的胚胎干細胞稱為孤雌胚胎干細胞。孤雌胚胎干細胞作為一種特殊的胚胎干細胞有著重要的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用價值，普通胚胎干細胞系由于主要組織相容復(fù)合物(MH

3、C)在不同個體之間存在顯著差異將可能導(dǎo)致移植后免疫排斥，而孤雌胚胎干細胞的MHC等位基因是純合子，因此從理論上將大大降低免疫排斥的可能性。近來己有文獻報道哺乳動物孤雌胚胎干細胞具有向三個胚層細胞分化的能力，因此孤雌胚胎干細胞將來也可以作為細胞治療的一個來源。 目的：探討小鼠孤雌胚胎干細胞在體外不經(jīng)過擬胚體(embryoid body,EB)階段，直接誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞的可行性。 材料與方法：昆明小鼠品系孤雌胚胎干細胞株m

4、PGES為山東大學(xué)省立醫(yī)院干細胞研究中心自建。該細胞株經(jīng)微衛(wèi)星技術(shù)檢測表明為孤雌來源，堿性磷酸酶呈陽性表達，表面標(biāo)志物Oct-4(octamer-binding transcription factor-4)、階段特異性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen，SSEA)-1呈陽性，SSEA-4陰性。表現(xiàn)正常二倍體核型，將mPGES接種于重度聯(lián)合免疫缺陷(severecombined immune de

5、ficiency,SCID)小鼠皮下8周后，出現(xiàn)腫塊，病理切片觀察可見三個胚層的組織，以上資料表明該細胞株具有胚胎干細胞特性。實驗采用階段誘導(dǎo)的方法，首先由孤雌胚胎干細胞向神經(jīng)前體細胞定向分化，通過巢蛋白(nestin)免疫熒光細胞化學(xué)染色對神經(jīng)前體細胞進行鑒定。在此基礎(chǔ)上，從培養(yǎng)基中撤除bFGF和EGF，加入5％胎牛血清，觀察已分化的神經(jīng)前體細胞能否進一步分化為神經(jīng)細胞，并對分化出的細胞進行免疫熒光細胞化學(xué)鑒定。 結(jié)果：經(jīng)選擇

6、培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后的孤雌胚胎干細胞絕大多數(shù)可誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細胞，細胞呈小圓形，棗核狀，多有兩個突起，在形態(tài)學(xué)上具有神經(jīng)前體細胞特征。經(jīng)nestin鑒定，絕大部分細胞呈nestin陽性。加入血清進一步誘導(dǎo)分化，大約培養(yǎng)lO天后，可觀察到有神經(jīng)上皮樣細胞存活。經(jīng)GFAP，β-Ⅲ-tubline鑒定，為β-Ⅲ-tubline陽性，說明存活細胞為早期神經(jīng)元細胞。 結(jié)論：(1)本實驗室所建的小鼠孤雌胚胎干細胞mPGES經(jīng)過體外誘導(dǎo)方成功誘導(dǎo)