小鼠和人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化.pdf

1、隨著老齡化時(shí)代的來臨,神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病越來越引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。研究胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES細(xì)胞)的體外神經(jīng)分化,得到大量的神經(jīng)前體細(xì)胞和特定類型的神經(jīng)元,有望為早期神經(jīng)發(fā)育的研究、神經(jīng)藥理和毒理研究以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的細(xì)胞替代治療提供研究模型和細(xì)胞來源。本研究針對(duì)小鼠和人ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化進(jìn)行了研究,主要包括了以下兩方面的工作:
　　 (一)小鼠ES細(xì)胞的神經(jīng)分化:我們研究的重點(diǎn)

2、和創(chuàng)新體現(xiàn)在密度對(duì)小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化的效率和細(xì)胞類型的研究上。本研究發(fā)現(xiàn),小鼠ES細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)環(huán)境里,ES細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)的接種密度對(duì)類胚體(embryonic body,EB)質(zhì)量有很大的影響并影響隨后的神經(jīng)分化效率:當(dāng)小鼠ES細(xì)胞以較低密度(1×105 ES cells/ml)懸浮培養(yǎng)時(shí),得到的EB形態(tài)較為均一,呈規(guī)則的圓形,EB的形態(tài)較緊密,邊界亮而光滑,這樣的EB貼壁培養(yǎng)后,神經(jīng)分化的效率較高,Nestin陽性細(xì)胞約占92

3、％；小鼠ES細(xì)胞以較高密度(1×106 ES cells/ml)懸浮培養(yǎng)時(shí),EB的大小不均一,形態(tài)不規(guī)則,邊界不光滑,這樣的EB貼壁培養(yǎng)后,神經(jīng)分化的效率較低,Nestin陽性細(xì)胞約占50％。本研究還發(fā)現(xiàn),EB貼壁培養(yǎng)時(shí)的接種密度也影響分化得到的神經(jīng)細(xì)胞類型:EB低密度貼壁培養(yǎng)后長出的細(xì)胞更傾向于表達(dá)后腦和脊髓特異性的定位基因Hoxb4、Hoxb9。
　　 (二)人ES細(xì)胞的神經(jīng)分化:首先我們采用EB法進(jìn)行了人ES細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)

4、分化,并且我們對(duì)該EB進(jìn)行了改進(jìn),從而提高了誘導(dǎo)效率。我們的誘導(dǎo)方案的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是在EB形成階段,用化學(xué)成分明確的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基替代了以往報(bào)道中選用的含血清的培養(yǎng)基從而提高了誘導(dǎo)效率；二是在EB貼壁后長出的玫瑰花結(jié)樣結(jié)構(gòu),我們用機(jī)械法挑取代替了以往報(bào)道中所采用的差別酶消化法從而提高了目的細(xì)胞的純度。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,這些改進(jìn)可以明顯提高人ES細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)效率。盡管通過以上實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn),我們用EB法誘導(dǎo)人

5、ES細(xì)胞的神經(jīng)分化得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)類胚體法有很多不足之處。單層貼壁誘導(dǎo)法是一種新的神經(jīng)誘導(dǎo)方法,細(xì)胞的分化較同步；而且細(xì)胞的形態(tài)改變易于觀察,細(xì)胞的分化進(jìn)展易于通過免疫組織化學(xué)染色等實(shí)驗(yàn)手段實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本研究在BMP4的抑制劑Noggin的作用下,應(yīng)有單層貼壁誘導(dǎo)法高效地把人ES細(xì)胞誘導(dǎo)成了神經(jīng)細(xì)胞,且神經(jīng)發(fā)生的時(shí)間早于EB法。我們的研究還初步證實(shí),單層貼壁誘導(dǎo)法的早期即添加FGF8和SHH可以大大促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)