人胚胎干細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)以及向神經(jīng)干細(xì)胞的分化研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文人胚胎干細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)以及向神經(jīng)干細(xì)胞的分化研究姓名：許慧芳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：張?zhí)K明20090506華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文64Ⅳ型膠原酶法傳代是兩株人胚胎干細(xì)胞在HAFi飼養(yǎng)層傳代的最佳方式。操作簡(jiǎn)單、污染幾率小、對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)影響也較低，不足之處在于會(huì)攜帶部分飼養(yǎng)層細(xì)胞同時(shí)傳代。結(jié)論結(jié)論HAFi細(xì)胞可以用做兩株中國(guó)人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，取代MEF后解決了動(dòng)物源

2、性細(xì)胞混雜和異源污染問(wèn)題，省卻了飼養(yǎng)層原代細(xì)胞的培養(yǎng)步驟同時(shí)解決了由不同批次飼養(yǎng)層差異帶來(lái)的培養(yǎng)體系的不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)還初步提示了兩株中國(guó)人胚胎干細(xì)胞與歐美國(guó)家建系的干細(xì)胞有所不同。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞人胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層永生化人成體成纖維細(xì)胞第二部分第二部分人胚胎干細(xì)胞無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立與鑒定人胚胎干細(xì)胞無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立與鑒定目的目的建立兩株中國(guó)人胚胎干細(xì)胞無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系，從根本上純化干細(xì)胞。方法方法用基質(zhì)膠（Matrigel）作為

3、細(xì)胞外基質(zhì)。分別使用MEF和HAFi飼養(yǎng)層上清獲得的條件培養(yǎng)基（MEFCM，HAFiCM），添加TGFβ1、Noggin和不同濃度bFGF的單因子非條件培養(yǎng)基以及FT、FTN、FTNI、TNI等多因子聯(lián)合非條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。觀察細(xì)胞在不同無(wú)飼養(yǎng)層體系的生長(zhǎng)情況，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分化率，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞傳代周期，從而對(duì)不同的無(wú)飼養(yǎng)層體系和因子作用做出評(píng)估；比較不同MEF飼養(yǎng)層密度獲得的MEFCM以及不同的傳代方法對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；對(duì)所得干

4、細(xì)胞進(jìn)行基本性質(zhì)的鑒定。結(jié)果結(jié)果1.兩株中國(guó)人胚胎干細(xì)胞可以在MEFCM、FM160、FM250以及FT、FTN、FTNI等多因子聯(lián)合培養(yǎng)基與基質(zhì)膠共同構(gòu)建的無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)。2.6105mL—12105mL的MEF飼養(yǎng)層密度適合獲取MEFCM。3.機(jī)械法傳代可以用于hESC從飼養(yǎng)層到無(wú)飼養(yǎng)層的轉(zhuǎn)移步驟，Ⅳ型膠酶法傳代可以用于無(wú)飼養(yǎng)層的長(zhǎng)期傳代。4.流式細(xì)胞檢測(cè)未分化率MEFCMFTNI≈FTNFTFM160≈FM250TNI5.