人胚胎干細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系的優(yōu)化.pdf

1、第一章、人胚胎干細(xì)胞(hESCs)向胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的比較
　　目的:通過比較文獻(xiàn)中已報(bào)道的效率較高的誘導(dǎo)方案，找到在本實(shí)驗(yàn)室條件下獲得胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞的最佳誘導(dǎo)方案。
　　方法:體外誘導(dǎo)hESCs需要依次經(jīng)歷限定性內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)分泌前體最終才會(huì)成為胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，這是體內(nèi)β細(xì)胞發(fā)育分化過程的重演。利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立好的條件，將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)至限定性內(nèi)胚層階段。然后分三組分別用D'Amour、Hongkui

2、Deng、 Hosoya實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的誘導(dǎo)方案將細(xì)胞往胰腺內(nèi)分泌前體誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)的第10天以及第13天收集樣本，用免疫熒光、間標(biāo)流式、real-time PCR等檢測(cè)手段比較三種誘導(dǎo)方案獲得胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞的效率。
　　結(jié)果:僅Hosoya小分子方案組在第10天至第13天的過程中PDX1+細(xì)胞的比例出現(xiàn)明顯的上調(diào);D'Amour組呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì);Hongkui Deng組呈現(xiàn)基本持平狀態(tài)。僅Hosoya小分子方案組在第10天至第

3、13天能持續(xù)檢測(cè)到較多的NGN3+細(xì)胞;D'Amour組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且NGN3+細(xì)胞比例很低;Hongkui Deng組幾乎檢測(cè)不到NGN3+細(xì)胞。
　　結(jié)論:僅Hosoya小分子方案能更好的將限定性內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞(PDX1+&NGN3+)。
　　第二章、人胚胎干細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性(Ins+)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究
　　目的:比較基礎(chǔ)培養(yǎng)基:D/F-12、高糖-DMEM;成熟因子

4、方案與Hosoya的小分子方案獲得胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的效率。
　　方法:利用第一章所得到的優(yōu)勢(shì)方案（小分子誘導(dǎo)方案），將hESCs誘導(dǎo)至胰腺內(nèi)分泌前體起始階段，即誘導(dǎo)的第10天。然后將細(xì)胞分為兩大組，其中一組用成熟因子方案誘導(dǎo)，另一組繼續(xù)用 Hosoya實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的小分子方案誘導(dǎo);分別考察兩種誘導(dǎo)方案下，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同葡萄糖濃度在誘導(dǎo)第18天獲得Ins+細(xì)胞的差異。用免疫熒光、間標(biāo)流式、real-time PCR等檢測(cè)手段比較各方案

5、獲得Ins+細(xì)胞的效率。
　　結(jié)果:高糖-DMEM加成熟因子組在誘導(dǎo)的第18天獲得Ins+細(xì)胞的效率最高，達(dá)27.43％±2.97％。D/F-12加成熟因子組、高糖-DMEM加小分子組和D/F-12加小分子組的Ins+細(xì)胞比例都不及21％。而追溯到誘導(dǎo)的第13天檢測(cè)成熟因子和小分子組在表達(dá)胰腺內(nèi)分泌前體階段標(biāo)記基因顯示成熟因子組PDX1、NGN3、Beta2基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量是小分子組的數(shù)倍結(jié)論:培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)終末形

6、成Ins+細(xì)胞效率在成熟因子組中高糖能促使β細(xì)胞增殖，低糖能使細(xì)胞內(nèi)Ins含量增加;而在小分子組中無(wú)區(qū)別。在獲得Ins+細(xì)胞效率上高糖-DMEM加成熟因子比小分子方案有優(yōu)勢(shì)，其原因可能并不是胰腺內(nèi)分泌前體階段，PDX1+&NGN3+細(xì)胞數(shù)量的多少，而與其PDX1和NGN3表達(dá)量有關(guān)。推測(cè)PDX1、NGN3的表達(dá)可能存在一個(gè)閾值是激活其下游基因啟動(dòng)所必須的。
　　第三章、人胚胎干細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)方案的

7、優(yōu)化
　　目的:以高糖-DMEM加成熟因子誘導(dǎo)方案為基礎(chǔ)優(yōu)化人胚胎干細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)方案。
　　方法:利用第一章所得到的優(yōu)勢(shì)方案（小分子誘導(dǎo)方案），將hESCs誘導(dǎo)至胰腺內(nèi)分泌前體起始階段，即誘導(dǎo)的第10天。以第二章中高糖-DMEM加成熟因子誘導(dǎo)方案為基礎(chǔ)進(jìn)行分組，將成熟因子Betacellulin、Exendin-4、IGF-1進(jìn)行自由組合，分為無(wú)因子組、單因子組、雙因子組、三因子組。將細(xì)胞

8、誘導(dǎo)至第18天，用免疫熒光、間標(biāo)流式、real-time PCR等檢測(cè)手段比較各方案獲得Ins+細(xì)胞的效率。
　　結(jié)果:在誘導(dǎo)第18天獲得Ins+細(xì)胞比例最高的三組分別為雙因子組中的Exendin-4&IGF-1、單因子組中的Exendin-4及IGF-1，其值分別為:32.63％±8.50％、31.60％±2.16％、30.63％±1.37％。其中單因子組中Exendin-4在real-time PCR檢測(cè)的各項(xiàng)胰島終末細(xì)胞標(biāo)記