人胰腺干細(xì)胞的體外擴(kuò)增及其向胰島素分泌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]優(yōu)化從人胚胎胰腺組織分離純化胰腺干細(xì)胞的方法，以最大限度地獲取胰腺干細(xì)胞，并將胰腺干細(xì)胞在體外大量擴(kuò)增后誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)，檢測(cè)其胰島素分泌功能，尋找能用于糖尿病的干細(xì)胞移植治療的資源，為糖尿病細(xì)胞移植治療的臨床運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]無(wú)菌條件下取孕3-6月齡人工流產(chǎn)胚胎胰腺組織，剪碎后用不同濃度Ⅳ型膠原酶在相同條件下消化分離得到胰島樣細(xì)胞團(tuán)(islet-like cellclusters，ICCs)，用差速貼

2、壁法分別培養(yǎng)ICCs和其他細(xì)胞，根據(jù)不同細(xì)胞的貼壁時(shí)間不同將不同細(xì)胞分離，進(jìn)一步培養(yǎng)后純化，得到相對(duì)純凈的細(xì)胞成分，比較不同條件下的實(shí)驗(yàn)效果。并比較不同種類培養(yǎng)基和不同濃度血清對(duì)細(xì)胞貼壁效果的影響。
　　 采用正交設(shè)計(jì)系統(tǒng)比較不同培養(yǎng)基、不同濃度血清和各種細(xì)胞因子組合(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)對(duì)胰腺干細(xì)胞增殖的影響，優(yōu)化胰腺干細(xì)胞的擴(kuò)增體系，篩選出本實(shí)驗(yàn)條件下的最佳培養(yǎng)體系，并以此系統(tǒng)對(duì)胰腺干細(xì)

3、胞進(jìn)行擴(kuò)增，分析擴(kuò)增后的細(xì)胞總數(shù)和胰腺干細(xì)胞標(biāo)志分子ABCG2和nestin陽(yáng)性細(xì)胞的擴(kuò)增能力。
　　 將經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的胰腺干細(xì)胞用胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producingcells，IPCs)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行分化誘導(dǎo)，使胰腺干細(xì)胞向IPCs分化。當(dāng)有胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ICCs)形成后，DTZ染色和胰島素免疫組化鑒定。然后用葡萄糖刺激的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)(glucose-stimulated insulin secretion，GS

4、IS)收集上清液，ELISA法檢測(cè)IPCs的胰島素分泌水平。
　　 [結(jié)果]從孕3-6月胚胎胰腺組織分離胰腺干細(xì)胞，在相同分離條件下，以Ⅳ型膠原酶濃度為0.25mg/ml分離效果最好，0.5mg/ml和1mg/ml濃度效果不佳；在不同種類培養(yǎng)液和不同濃度的血清中，L-DMEM與15％小牛血清組合效果最佳，H-DMEM和RPMI1640與其他濃度血清的組合效果不好；ICCs在L-DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)36小時(shí)貼壁，其它細(xì)胞貼壁較早，

5、據(jù)此特性可以將ICCs與其他細(xì)胞分開并進(jìn)一步得到純化的胰島干細(xì)胞(胰腺干細(xì)胞的主要成分)。
　　 不同濃度血清、EGF、bFGF、HGF對(duì)人胚胎胰腺干細(xì)胞的增殖有不同影響，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明15％的血清，15 ng/ml EGF，5ng/ml HGF，15ng/ml bFGF最有利于胰腺干細(xì)胞的增殖。在最佳培養(yǎng)條件下，胰腺干細(xì)胞擴(kuò)增良好：連續(xù)擴(kuò)增15代后，細(xì)胞總數(shù)可達(dá)原來(lái)的1010倍；具有胰腺干細(xì)胞標(biāo)志的ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞和nes

6、tin陽(yáng)性細(xì)胞可達(dá)原來(lái)的1012倍，且ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞的擴(kuò)增能力要優(yōu)于nestin陽(yáng)性細(xì)胞；免疫組化染色和流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示人胚胎胰腺干細(xì)胞nestin和ABCG2抗原表達(dá)陽(yáng)性，分別為(38.22±0.37)％和(53.33±7.02)％，且存在(37.3±0.79)％的nestin和ABCG2抗原共表達(dá)。
　　 胰腺干細(xì)胞在誘導(dǎo)液1：無(wú)糖DMEM+15％NBS+10mmol/L，NIC+10ng/mlHGF+不同濃度的

7、葡萄糖(0 mmol/L、2.8 mmol/L、5.6 mmol/L和11.2 mmol/L)和誘導(dǎo)培養(yǎng)液2：L-DMEM+15％血清+10mmol/L NIC+不同濃度的HGF(0ng/ml、5ng/ml和10ng/ml)中連續(xù)誘導(dǎo)15天后，出現(xiàn)ICCs，且ICCs DTZ染色陽(yáng)性，胰島素免疫組化染色陽(yáng)性。葡萄糖刺激的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)(GSIS)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)液中葡萄糖濃度為2.8mmol/l時(shí)，胰島素分泌量最高為(48.97±1.80)

8、μIU；當(dāng)葡萄糖的濃度一定時(shí)，誘導(dǎo)液中HGF濃度為10ng/ml時(shí)胰島素分泌量最高為(47.42±1.20)μIU。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了人胚胎胰腺干細(xì)胞的分離純化方法。在相同分離條件下，以Ⅳ型膠原酶濃度為0.25mg/ml分離效果最好；根據(jù)ICCs與其它胰腺細(xì)胞貼壁時(shí)間不同，以36h為分界線，可以進(jìn)一步得到純化的胰島干細(xì)胞；在不同種類培養(yǎng)液和不同濃度的血清中，L-DMEM與15％小牛血清組合效果最佳。