體外誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向韌帶細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells， hAMSCs）是否具有MSCs的特性及經(jīng)誘導(dǎo)后在體外能否向韌帶細(xì)胞分化。
　　方法：取產(chǎn)婦胎盤通過(guò)酶消化法獲得 hAMSCs，流式細(xì)胞術(shù)鑒定 hAMSCs表型特征。取第3代hAMSCs分別加入含不同誘導(dǎo)液的LG-DMEM/F12培養(yǎng)基：A組TGF-β1＋bFGF，B組透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA），C組 TGF-β1

2、＋bFGF＋HA， D組為空白對(duì)照組。倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)后21 d各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）比色法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)活性；誘導(dǎo)后7、14、21 d分別采用免疫組織化學(xué)染色及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)韌帶特異性蛋白和基因表達(dá)。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果表明 hAMSCs表達(dá) MSCs表型。倒置相差顯微鏡觀察示誘導(dǎo)21 d A、B、C組細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，C組細(xì)胞形態(tài)更單一、

3、有明顯方向性且較 A組排列更緊湊。SRB比色法檢測(cè)示各組細(xì)胞于培養(yǎng)6 d左右達(dá)增殖高峰，6d時(shí) A、B、C組細(xì)胞活性均顯著高于 D組。免疫組織化學(xué)結(jié)果示：誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，各組均未檢測(cè)到 TNC表達(dá)；7、14、21 d A、B、C組Ⅰ型膠原表達(dá)均顯著高于D組，14、21 d A、B、C組Ⅲ型膠原表達(dá)顯著高于 D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.001）。 B組Ⅰ型膠原表達(dá)以及 A、C組Ⅲ型膠原、TNC表達(dá)隨時(shí)間增加均呈逐漸增高趨勢(shì)，各時(shí)間

4、點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.001）。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果示：誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d， C組Ⅰ型膠原、TNC mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于 A、B組，B組Ⅲ型膠原 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于 A、C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05）。A、C組Ⅰ型膠原、TNC以及C組Ⅲ型膠原 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間增加呈逐漸上調(diào)趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　結(jié)論：hAMSCs具有MSCs的特性，有良好