體外共培養(yǎng)條件下定向誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向人前交叉韌帶成纖維細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1）探討人羊膜間充質(zhì)干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）是否具有MSCs的特性及純度。
　　2）比較膠原酶消化法與原位組織塊培養(yǎng)法對分離人前交叉韌帶成纖維細胞（human anterior cruciate ligament fibroblasts，hACLFs）的效果；探討使用堿性成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)G

2、F）作用于人前交叉韌帶成纖維細胞后細胞形態(tài)學(xué)改變、增殖及相關(guān)基因和蛋白表達的效應(yīng)。
　　3）探討體外聯(lián)合生長因子行單純誘導(dǎo)、單層共培養(yǎng)及Transwell共培養(yǎng)定向誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向人前交叉韌帶成纖維細胞分化的效果。
　　方法：
　　1）取產(chǎn)婦胎盤用胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法分離獲得hAMSCs。流式細胞術(shù)分析鑒定hAMSCs表型分子，CCK-8法檢測hAMSCs增殖活性，免疫熒光染色檢測第3代hAMSCs的CK-1

3、9和波形蛋白表達。分別使用茜素紅、甲苯胺藍及油紅O染色法檢測7d和21d時hAMSCs向成骨、成軟骨及成脂細胞分化后的效果。對成骨細胞行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性檢測。實時熒光定量PCR檢測向成骨、成軟骨及成脂細胞誘導(dǎo)7d、21d時相關(guān)基因表達水平。
　　2）分別使用膠原酶消化法和組織塊原位培養(yǎng)法分離hACLFs，倒置相差顯微鏡觀察兩種方法分離的細胞形態(tài)，CCK-8法檢測兩種分離方法細胞增殖

4、能力；流式細胞術(shù)檢測hACLFs細胞表型；使用bFGF培養(yǎng)第3代hACLFs后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、CCK-8法檢測細胞增殖活性，分別在第7d、10d及14d時行免疫熒光染色觀察細胞I、III型膠原，纖維連接蛋白（Fibronectin）及細胞連接素（Tenascin-C）的表達，實時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡試驗（Western blot）檢測韌帶相關(guān)基因及蛋白水平改變。
　　3）聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(trans

5、forming growth factor-β，TGF-β1）和bFGF作為誘導(dǎo)劑置于LG-DMEM/F12培養(yǎng)基中。使用第3代hAMSCs和hACLFs，按照單純誘導(dǎo)、單層共培養(yǎng)及Transwell共培養(yǎng)進行分組：單純誘導(dǎo)組（A組）、單純非誘導(dǎo)組（B組）、單層共培養(yǎng)誘導(dǎo)組（C組）、單層共培養(yǎng)非誘導(dǎo)組（D組）、Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組（E組）及Transwell共培養(yǎng)非誘導(dǎo)組（F組）。共培養(yǎng)組兩種細胞密度調(diào)整為104/ml比例為1

6、:1，其中C、D兩組中的hACLFs在共培養(yǎng)前24h內(nèi)使用Arab-C（終濃度為5μg/ml）以特異性殺滅處于S期的成纖維細胞。倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)。CCK-8法檢測各組細胞的增殖活性，分別于7d、14d和21d時：免疫熒光染色觀察各組細胞I、III型膠原，F(xiàn)ibronectin及Tenascin-C的表達情況，實時熒光定量PCR法檢測各組韌帶相關(guān)基因表達水平，苦味酸天狼猩紅染色法觀察各組細胞總膠原表達，Western blo

7、t檢測各組細胞中韌帶相關(guān)蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1）胰酶-膠原酶聯(lián)合消化法可獲得大量可穩(wěn)定增殖的hAMSCs。流式細胞術(shù)鑒定結(jié)果表明hAMSCs表達MSCs表型。第3代hAMSCs高表達波形蛋白，低表達CK-19。茜素紅染色顯示，成骨誘導(dǎo)后細胞存在多個礦化結(jié)節(jié)，細胞中堿性磷酸酶活性明顯增加；甲苯胺藍染色顯示，成軟骨誘導(dǎo)后細胞基質(zhì)中分泌大量的糖胺聚糖；油紅O染色顯示，成脂誘導(dǎo)后，細胞漿內(nèi)可見脂滴。實時熒光PCR結(jié)果顯示，

8、成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)21d后，相關(guān)基因表達較7d時明顯增高（P<0.05）。
　　2）流式細胞術(shù)結(jié)果顯示體外分離的hACLFs表達成纖維細胞相關(guān)表型分子。使用兩種分離方法分離的細胞形態(tài)學(xué)在傳至第2代時發(fā)生改變，組織塊原位培養(yǎng)法分離的細胞數(shù)量更多，呈長梭形、雙極樣生長，形態(tài)更加趨近于成纖維細胞，膠原酶消化法分離的細胞數(shù)量較少，呈短棒、不規(guī)則狀。組織塊原位培養(yǎng)法分離的hACLFs增殖能力顯著高于膠原酶消化法（P<0.05）。bFGF

9、作用于第3代hACLFs后，細胞增殖能力顯著提高（P<0.05），細胞呈長梭形、成纖維樣生長且極性明顯。免疫熒光染色顯示使用bFGF培養(yǎng)的細胞其I、III型膠原，F(xiàn)ibeonectin和Tenascin-C表達有顯著提高；PCR結(jié)果顯示bFGF培養(yǎng)組中I、III型膠原、Fibronectin、Tenascin-C，基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、賴氨酰氧化酶-1（lysyl oxi

10、dase-1，LOX-1）的mRNA表達水平顯著上調(diào)（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示加入 bFGF培養(yǎng)的hACLFs其 I、III型膠原蛋白表達水平顯著高于對照組（P<0.05）。
　　3）使用誘導(dǎo)因子的各組其細胞增殖水平顯著高于未使用誘導(dǎo)因子組（P<0.05）。免疫熒光染色顯示I、III型膠原，F(xiàn)ibeonectin和Tenascin-C表達水平隨時間延長而增加，使用誘導(dǎo)因子各組蛋白表達水平高于非誘導(dǎo)組，其中T

11、ranswell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時蛋白表達較其他組更高。PCR結(jié)果顯示I、III型膠原、Fibronectin、Tenascin-C， MMP-2、LOX-1、α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的mRNA表達水平于14d和21d時顯著上調(diào)（P<0.05），Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時，I、III型膠原、MMP-2、LOX-1、α-SMA其表達高于其他組。Western blot結(jié)果顯示

12、Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組于21d時I、III型膠原蛋白表達水平顯著高于其他組（P<0.05）。苦味酸天狼猩紅染色結(jié)果顯示21d時Transwell共培養(yǎng)誘導(dǎo)組總膠原水平最高，較其他組有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1) 人羊膜間充質(zhì)干細胞具有MSCs的特征并且可以向成骨細胞，軟骨細胞及脂肪細胞的潛能，可選作為組織工程學(xué)的種子細胞。
　　2）體外成功分離hACLFs，并表達成纖維細胞的表型分子；證實

13、組織塊原位培養(yǎng)法分離的細胞增殖效率更高,獲得細胞數(shù)量更多，形態(tài)學(xué)更趨近于成纖維細胞。
　　3）bFGF可提高hACLFs體外增殖能力,細胞形態(tài)更趨向成纖維細胞特性,韌帶相關(guān)特異性基因及蛋白表達增加。
　　4）bFGF聯(lián)合TGFβ-1可促進hAMSCs向hACLFS分化；單層共培養(yǎng)與Transwell共培養(yǎng)較單純誘導(dǎo)方法,細胞分化效果更加明顯；在基因、蛋白及膠原分泌水平上, Transwell共培養(yǎng)方式比單層共培養(yǎng)誘導(dǎo)效果更強