成人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探索成人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Adiposederivedmesenchymalstemcells，ADMSCs)體外分離方法并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察其基本生物學(xué)特性；在不同濃度及不同誘導(dǎo)時(shí)間下5-氮雜胞苷(5-Azacytidine，5-aza)誘導(dǎo)使其向心肌細(xì)胞方向分化，確定最佳誘導(dǎo)條件，并進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定。為今后自體干細(xì)胞心肌移植治療心肌壞死性疾病提供理論基礎(chǔ)及理想的細(xì)胞種子來源。 方法：按照Zuk.PA等的酶消化

2、貼壁法體外分離成人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代擴(kuò)增培養(yǎng)純化細(xì)胞，相差顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；四氮唑藍(lán)比色法(MTT法)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期及細(xì)胞表面分子CD44、CD34的表達(dá)；已純化第四代細(xì)胞分組用不同濃度5-aza誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間，使其向心肌細(xì)胞分化；分別于誘導(dǎo)后14、28天時(shí)制備電鏡標(biāo)本行心肌樣細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，免疫細(xì)胞化學(xué)分析心肌特異性肌鈣蛋白I(cTn-I)、縫隙連接蛋白43(Connecxi

3、n-43,Cx-43)及結(jié)蛋白(Desmin)的表達(dá)并計(jì)算心肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，反轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)心肌特異性β-肌球蛋白重鏈(Cardiacβ-MHC)基因的表達(dá)情況。 結(jié)果：初分離的ADMSCs光鏡下形態(tài)呈梭形成纖維樣、三角形和多角形，并混有大量未貼壁的懸浮紅細(xì)胞，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)及數(shù)次傳代后細(xì)胞漸得以純化，呈均一的梭形貼壁生長(zhǎng)；電鏡下觀察可見少量細(xì)胞器，結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，細(xì)胞處于較幼稚階段；細(xì)胞

4、生長(zhǎng)曲線呈S形，顯示ADMSCs在體外生長(zhǎng)迅速，約經(jīng)1～2天潛伏期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，平均增殖周期約為30小時(shí)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)89.6％細(xì)胞CD44表達(dá)陽性、CD34陰性；細(xì)胞周期分析顯示76.2％細(xì)胞處于G0/G1期、S期細(xì)胞占8.7％、G2/M細(xì)胞占15.1％；5-aza誘導(dǎo)后7～10天，細(xì)胞體積開始增大，細(xì)胞形態(tài)趨向于心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)后28天時(shí)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槎贪魻罴安灰?guī)則星狀，類似于心肌樣細(xì)胞；與對(duì)照組比較，誘導(dǎo)后14天時(shí)透射電鏡下

5、未見有肌樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而28天時(shí)胞槳內(nèi)可觀察到大量的肌絲結(jié)構(gòu)；免疫細(xì)胞化學(xué)顯示cTn-I、Cx-43及Desmin在誘導(dǎo)后14天時(shí)無表達(dá)，在誘導(dǎo)后28天時(shí)表達(dá)陽性；5-aza誘導(dǎo)ADMSCs分化為心肌細(xì)胞的有效濃度在5～15μmol/L之間，有效誘導(dǎo)時(shí)間在12～48小時(shí)之間，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示以10μmol/L濃度誘導(dǎo)24小時(shí)的心肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率最高，為32.50％±3.85；RT-PCR法檢測(cè)Cardiacβ-MHC基因在誘導(dǎo)后14天時(shí)無表達(dá)，