蒙古羊間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)分化.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。對許多物種的研究證明這類干細(xì)胞在體外可分化為多種細(xì)胞表型，是未來細(xì)胞、基因治療、組織工程的理想種子細(xì)胞之一。
　　目前尚未見綿羊尤其是蒙古綿羊間充質(zhì)干細(xì)胞的研究報道。本研究旨在建立蒙古羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）和脂肪間充

2、質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs）系，了解其生物學(xué)特征，并在體外進(jìn)行成脂、成骨和軟骨誘導(dǎo)分化與鑒定，為今后利用這類間充質(zhì)干細(xì)胞作為疾病細(xì)胞、基因治療的模型，以及將其作為體細(xì)胞克隆核供體的研究奠定必要的基礎(chǔ)。
　　本文以成年蒙古綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)對象，采集股骨骨髓和腎臟外圍脂肪組織，采用密度梯度離心法和膠原酶消化法獲得骨髓和脂肪間充質(zhì)細(xì)胞，系統(tǒng)地研究了其生物學(xué)特性以及體外誘導(dǎo)

3、分化能力。主要結(jié)果如下：
　　1、分離得到的蒙古羊BMSCs和ADSCs形態(tài)均呈現(xiàn)長梭形，易形成細(xì)胞集落。二者生長曲線都表現(xiàn)為S形。經(jīng)計(jì)算其細(xì)胞倍增時間，BMSCs平均為31h,ADSCs平均為30h。
　　2、對傳代10代（P10）、20代（P20）、30代（P30）BMSCs和ADSCs進(jìn)行染色體核型分析，正常核型率分別P10：90%（49/54）、85%（46/54）；P20:87%（47/54）、83.3%(45/5

4、4)；P30:81%（44/54）、88%（48/54）。表明間充質(zhì)細(xì)胞在體外長期傳代培養(yǎng)中，能保持較強(qiáng)的增殖能力和較好的遺傳穩(wěn)定性。
　　3、在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，蒙古羊BMSCs和ADSCs在誘導(dǎo)兩周左右時，細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形的成熟脂肪細(xì)胞形狀，內(nèi)分布大量脂滴。油紅O染色呈陽性，RT-PCR可檢測到脂肪特異性基因Leptin和PPAR的表達(dá)。在組織學(xué)和基因水平證實(shí)BMSCs和ADSCs可分化成為脂肪細(xì)胞。
　　4、經(jīng)成

5、骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)，兩周左右細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)礦化骨結(jié)節(jié)，約三周時，骨結(jié)節(jié)更明顯。茜素紅、Von Kossa和堿性磷酸酶（ALP）染色均呈陽性。RT-PCR檢測，表達(dá)了骨細(xì)胞特異基因Osteocalcin及CBFA，證明成功將BMSCs和ADMCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。
　　5、在三維立體成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)約4周后，BMSCs和ADSCs誘導(dǎo)為軟骨顆粒，經(jīng)甲醛固定、包埋切片，HE和Alcian Blue染色均呈現(xiàn)陽性。RT-PCR鑒定表明，兩類細(xì)胞均表達(dá)