山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離與培養(yǎng).pdf

1、該研究基于細(xì)胞工程與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合,把誘骨因子hBMP-2基因整合到靶細(xì)胞BMSC中,再將BMSC植入骨損傷處,讓hBMP-2基因在體內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá),從而達(dá)到hBMP-2基因基因治療的目.所作的工作如下:1.采用密度梯度離心(Percoll分離液)法將BMSC從山羊骨髓血液中分離出來(lái),置于低糖DMEM中進(jìn)行傳代培養(yǎng).利用換液的方法對(duì)其純化,接種兩小時(shí)后開(kāi)始貼壁,貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈典型的成纖維細(xì)胞樣外觀.原代與傳代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線都為S型

2、,但是傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度比原代快.傳代培養(yǎng)的結(jié)果顯示,在經(jīng)歷了9代培養(yǎng)以后,山羊BMSC才出現(xiàn)衰老征象.與原代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線相比,傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)潛伏期短,每代只要9天就可鋪滿培養(yǎng)皿底壁.2.參考上皮細(xì)胞的冷凍方法,用含不同濃度的血清和DMSO的冷凍液進(jìn)行冷凍,以解凍后的細(xì)胞貼壁率為標(biāo)準(zhǔn),篩選理想的冷凍液.發(fā)現(xiàn)凍存液DMEM+10%FBS+10%DMSO與DMEM+15%FBS+10%DMSO對(duì)山羊BMSC的冷凍有著相同的效果

3、,因此選擇DMEM+10%FBS+10%DMSO為山羊BMSC的冷凍液.3.取P1、P5和P9代細(xì)胞制備細(xì)胞爬片,用β-巰基乙醇/當(dāng)歸注射液分別對(duì)其進(jìn)行定向誘導(dǎo),每隔30min在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,用免疫組織化學(xué)鑒定.結(jié)果表明β-巰基乙醇和當(dāng)歸注射液對(duì)山羊BMSC有同樣的誘導(dǎo)效果,兩種方法誘導(dǎo)后的細(xì)胞70%以上表達(dá)神經(jīng)絲蛋白(NF)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE).說(shuō)明山羊BMSC同樣可以被誘導(dǎo)成為神經(jīng)樣細(xì)胞,同時(shí)也說(shuō)明了采用

4、Percoll分離液進(jìn)行梯度密度離心后分離的細(xì)胞為BMSC.4.采用TRIZOL法從人胎盤(pán)組織中提取總RNA,通過(guò)RT-PCR方法獲得編碼hBMP-2的基因,重組到pMD-18T載體上后在大腸桿菌中克隆,經(jīng)檢測(cè),所獲得的基因序列與基因文庫(kù)中hBMP-2基因同源性為99.9%,即成功的克隆出了hBMP-2基因,為進(jìn)一步研究hBMP-2基因在BMSC中的高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ).5.把目的基因從重組質(zhì)粒上切下來(lái),插入到熒光表達(dá)載體(pEGFP-C