兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為胰島細(xì)胞的研究.pdf

1、糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病。胰島移植是最有希望治療糖尿病的方法之一，但胰島移植后，胰島的功能會在半年到幾年內(nèi)逐漸消失，且面臨著供體缺乏和免疫排斥的問題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓中除造血干細(xì)胞之外的另一類具有高度增殖和自我更新能力以及多向分化潛能的成體干細(xì)胞，易于體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增，在特定的條件下可以分化為胰島細(xì)胞，且

2、避免利用胚胎干細(xì)胞涉及的理論問題和誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞所產(chǎn)生的技術(shù)安全性問題，是一種理想的組織工程種子細(xì)胞。然而如何使BMSCs穩(wěn)定、高效地定向分化為胰島細(xì)胞，并搞清楚相關(guān)誘導(dǎo)方案中BMSCs分化為胰島細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制是一個巨大的挑戰(zhàn)。本研究以1月齡日本大耳白兔為實驗對象，體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增兔BMSCs，觀察兔BMSCs形態(tài)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定兔BMSCs；建立穩(wěn)定的兔BMSCs定向分化為胰島細(xì)胞的誘導(dǎo)方案，并分析兔BMSCs體外

3、定向分化為胰島細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制；探索DNA甲基化抑制劑5-aza-dc對兔BMSCs的最適干預(yù)濃度和其對胰島細(xì)胞分化的影響。本實驗為進(jìn)一步探索更成熟的誘導(dǎo)方案和BMSCs替代治療糖尿病提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
　　1.本試驗采用全骨髓貼壁法分離獲得的兔BMSCs生長增殖能力強(qiáng)，生物學(xué)性狀穩(wěn)定。對分離到的骨髓細(xì)胞通過24h首次半量換液，以后每2d換液一次，1:2傳代培養(yǎng)至第3代。細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定P3代細(xì)胞，結(jié)果顯示：其陽性表達(dá)C

4、D44、CD90，陰性表達(dá)CD34，這符合BMSCs表面分子標(biāo)記特征，且傳代至第3代可獲得大量生長良好、增殖能力強(qiáng)的兔BMSCs。這表明所獲第3代細(xì)胞為兔BMSCs，所用分離純化培養(yǎng)方法是一種比較理想的體外分離純化培養(yǎng)兔BMSCs的方法，并且可選用P3代兔BMSCs作為后續(xù)研究的實驗對象，為接下來的誘導(dǎo)試驗奠定了基礎(chǔ)。
　　2.本試驗采用DMSO聯(lián)合高糖對第3代兔BMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)，于倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)組和對照組細(xì)胞形態(tài)變化

5、，雙硫腙染色鑒定細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光染色鑒定Insulin蛋白的表達(dá)，RT-qPCR法檢測誘導(dǎo)過程中胰島細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)情況。得出以下結(jié)論：①Foxa2、Nestin、Pax6基因不能被選為兔BMSCs向胰島細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功的標(biāo)志基因。②DMSO聯(lián)合高糖能夠?qū)⑼肂MSCs誘導(dǎo)分化為具有胰島素分泌功能的胰島樣細(xì)胞，兔BMSCs具有向內(nèi)胚層細(xì)胞分化的潛能。③DMSO能夠激活Pdx-1基因的表達(dá)，從而起到促進(jìn)兔BMSCs分化為可分泌胰島素的胰

6、島前體細(xì)胞的作用。④高糖能夠促進(jìn)胰島前體細(xì)胞的成熟和兔BMSCs向胰島細(xì)胞的分化，該促進(jìn)作用可能主要是通過促進(jìn)Pdx-1和Foxa2基因的表達(dá)來完成的。
　　3.本試驗采用MTT法檢測不同濃度5-aza-dc干預(yù)第3代兔BMSCs24h后對其體外增殖能力的影響，并確定最適干預(yù)濃度；用篩選出的最適干預(yù)濃度的5-aza-dc干預(yù)兔BMSCs24h后，采用DMSO聯(lián)合高糖法進(jìn)行誘導(dǎo)，于倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)組和對照組細(xì)胞形態(tài)變化，雙硫腙染

7、色鑒定細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光染色鑒定Insulin蛋白的表達(dá)，RT-qPCR法檢測誘導(dǎo)過程中5-aza-dc對胰島細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。得出以下結(jié)論：①5-aza-dc對兔BMSCs的最適干預(yù)濃度為1.5μmol/L。②5-aza-dc能夠促進(jìn)胰島前體細(xì)胞的成熟和兔BMSCs向胰島細(xì)胞的分化，該促進(jìn)作用可能是通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性使得Pax6、Pdx-1和Insulin基因去甲基化，從而導(dǎo)致Pax6、Pdx-1和Insulin基因