PDX-1基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞.pdf

1、目的：通過人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的定向誘導(dǎo)，探討成骨等多分化潛能。利用PDX-1基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人骨髓MSCs對其進(jìn)行基因修飾，使之分化為能分泌胰島素的細(xì)胞，探討人骨髓MSCs在糖尿病治療領(lǐng)域的價值。 方法：1.Percoll密度梯度離心法從成人骨髓血中分離MSCs;第3代細(xì)胞經(jīng)CD44抗體、CD45抗體、CD34抗體等免疫熒光方法鑒定；通過細(xì)胞生長曲線及電鏡觀察其生物學(xué)性狀。2.第3代細(xì)胞采用含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維

2、生素C誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，堿性磷酸酶(ALP)染色，觀察MSCs的形態(tài)變化，未誘導(dǎo)組作為平行對照。3.PT-PCR方法擴(kuò)增出入PDX-1基因cDNA片段，構(gòu)建了含PDX-1基因的重組載體PEGFP-N1-PDX-1，并轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。用熒光顯微鏡觀察形態(tài)變化，免疫熒光鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞PDX-1蛋白的表達(dá)，雙硫腙染色鑒定懸浮細(xì)胞團(tuán)，電化學(xué)發(fā)光法法檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分泌胰島素情況。 結(jié)果：通過測序、PCR、酶切等確定PDX-1基因已正確插入

3、重組質(zhì)粒，通過熒光顯微鏡觀察有綠色熒光蛋白的表達(dá)，證實(shí)有效轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后1周后的細(xì)胞PDX-1蛋白表達(dá)陽性。轉(zhuǎn)染2周后，人骨髓MSCs可見半懸浮的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，雙硫腙染色為陽性。電化學(xué)發(fā)光法測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞高糖與低糖刺激后的胰島素分泌量。 結(jié)論：成功構(gòu)建了含人PDX-1基因的重組載體PEGFP-N1-PDX-1。PDX-1基因重組載體能夠?qū)肴斯撬鐼SCs并穩(wěn)定表達(dá)，且分化為胰島素分泌細(xì)胞。為表達(dá)PDX-1基因的骨