人羊水來源干細胞體外誘導分化為胰島素分泌細胞的研究.pdf

1、糖尿病依然是困擾人類健康的重要疾病之一，目前，胰島細胞移植治療是較為理想的治療方法，然而供體的匱乏限制了這一治療手段的廣泛開展。干細胞是一類具有自我更新及多向分化潛能的細胞，可以為細胞移植治療提供優(yōu)良的種子細胞，給胰島功能受損的糖尿病患者帶來了新的希望。然而胚胎干細胞及成體干細胞，如骨髓間充質干細胞，因受倫理限制或來源與數量的限制，使人們對尋找新的干細胞來源給與了更多的關注。最近幾年的研究顯示，羊水來源的干細胞(human amniot

2、icfluid-derived stem cells，hAFSCs)作為一種新的種子細胞來源，顯示了較好的優(yōu)勢：它們易于分離、培養(yǎng)、擴增，具有較低的免疫原性，體內移植實驗未見成瘤報道，具有多向分化潛能，可分化為骨細胞、神經細胞、肝細胞等。
　　 目前關于hAFSCs誘導分化為胰島細胞或胰島素分泌細胞的研究依然處于初期階段，相關論文僅一篇。通過文獻調研，我們還發(fā)現神經元限制性沉默因子(neuronalrestrictive sil

3、encing factor，NRSF)在干細胞向神經和胰島分化過程中可能發(fā)揮了重要作用。胰島細胞中的配對盒基因4(paired box gene4，Pax4)、胰島-腦1(Islet-Brain1，IB1)/JNK相互作用蛋白1(JNK-interacting protein1，JIP-1)以及連接蛋白36(Connexin36)等基因的表達受到NRSF的調控。Pax4是決定胚胎時期內分泌祖細胞定向分化為β細胞的重要的轉錄因子。IB1/

4、JIP-1和Connexin36分別是調控胰島β細胞的存活及分泌胰島素功能的重要成分。胰島細胞中存在著這些NRSF調控的靶基因提示著NRSF在胰島細胞的發(fā)育過程中可能扮演著重要的角色。此外，在胰島素瘤細胞系中過表達NRSF會破壞其葡萄糖.胰島素分泌偶聯機制，而在胰島β細胞中表達NRSF則導致葡萄糖耐受和β細胞數目減少。因此，采用RNA干擾技術干涉hAFSCs中NRSF的表達，以使hAFSCs能夠分化為分泌胰島素的細胞，并為糖尿病的細胞移

5、植治療提供新的細胞來源，也就成了本實驗研究的目的。
　　 研究分為兩部分：
　　 第一部分：人羊水來源干細胞的分離培養(yǎng)與生物學性狀分析：
　　 方法：取孕中期產前診斷所抽取的羊水組織，離心收集細胞，然后培養(yǎng)擴增。通過形態(tài)學觀察、姬姆薩顯帶核型分析、細胞增殖能力測定、流式細胞術、細胞免疫熒光染色及RT-PCR實驗等對其基本生物學性狀，尤多能性標志進行了較為系統的分析。
　　 我們鑒定hAFSCs的多能性，主

6、要以胚胎干細胞已確證的干性標記為標準，檢測了階段特異性胚胎抗原4(stage specific embryonic antigen-4 SSEA-4)、Nanog與Oct4等的表達情況。SSEA-4是一種膜表面糖脂，主要表達在從受精卵到囊胚期內細胞團細胞及原始生殖細胞表面，隨發(fā)育進行而逐漸減少，成體時主要表達在少數的骨髓間充質干細胞上，是細胞全能性的重要標志之一。Nanog是一種轉錄因子，開始表達于桑葚胚細胞到囊胚期內細胞團細胞及原始生

7、殖細胞內，后主要表達在外胚層細胞并隨發(fā)育的進行而逐漸消失，其主要功能是參與胚胎干細胞全能性及胚胎外胚層亞全能性的維持，是細胞全能性的重要標志之一。Oct4也是一種胚胎早期細胞內的轉錄因子，是人多能干細胞的標志之一，主要表達于人胚胎干細胞，原始生殖細胞內。
　　 結果：原代羊水細胞可在5至14天形成細胞群落，細胞呈現兩種形態(tài)，一部分為成纖維細胞樣，一部分為上皮細胞樣，后者在傳代過程中逐漸消失，到第3代以后，細胞在形態(tài)上即可表現為較

8、為均一的成纖維細胞形態(tài)。在上述培養(yǎng)條件下hAFSCs具有良好的增殖能力，群體倍增時間約為36h；經長期傳代培養(yǎng)，核型保持穩(wěn)定；流式細胞術檢測結果表明，階段特異性胚胎抗原4(SSES-4)表達率可達80％以上，間充質來源標志CD29、CD90與CD105表達率可達90％以上，主要組織相容性復合物Ⅰ類抗原(MHC classⅠ，HLA-ABC)較強表達，而MHC classⅡ(HLA-DR)未檢測到表達；同時，免疫熒光等技術也證實hAFSC

9、s表達部分胚胎發(fā)育早期的標志如SSES-4、Nanog、Oct4及Rex1。
　　 第二部分：神經元限制性沉默因子在人羊水來源干細胞向胰島素分泌細胞分化中的作用研究：
　　 方法：構建帶有綠色熒光蛋白基因的NRSF干涉載體(siNRSF)與打散對照載體(siControl)，經慢病毒介導感染hAFSCs。感染第3天利用定量PCR與western blot等技術檢測干涉效率。感染后的細胞在誘導培養(yǎng)基下進行誘導培養(yǎng)，誘導分為

10、兩個階段。在第7天與第14天，細胞經RT-PCR與免疫熒光染色鑒定胰島發(fā)育相關基因的表達；在第14天用5.5mM與23mM葡萄糖刺激誘導后的細胞，用超敏ELISA試劑盒檢測C-肽釋放量及細胞內的C-肽含量，用BCA法測定細胞總蛋白含量，并計算C-肽所占比例。
　　 結果：經熒光顯微鏡觀察，慢病毒介導的感染效率可達90％以上，干涉載體導入羊水來源干細胞之后的第三天，細胞內源性NRSF表達降低了70％左右，干涉效率明顯，同時RT-P

11、CR結果顯示胰島細胞發(fā)育相關基因Pax4表達上調，胰島素基因啟動子活性增強，胰島素基因也開始微弱表達。在誘導后的第7天至第14天，胰島細胞發(fā)育相關基因，如.Pdx1，Isl-1，Nkx6.1都相應表達，胰島素基因(Insulin)明顯表達。在誘導后的細胞中亦發(fā)現葡萄糖轉運蛋白2(Glut2)的表達，說明誘導后的細胞可能具有葡萄糖感應能力。在對照組中，雖然經過誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)，但未檢測到Pdx1，Isl-1，Nkx6.1，Insulin，

12、and Glut2的表達。經免疫熒光染色顯示誘導后的細胞，Pdx1、胰島素與C-肽都能檢測到表達，而對照組未發(fā)現表達。ELISA結果顯示，實驗組C-肽胞內含量約為1.24ng/mg，而對照組幾乎檢測不到。經低濃度與高濃度葡萄糖刺激后，干涉組C-肽釋放量顯著高于對照組，且表現出了較好的葡萄糖應答反應。
　　 結論：hAFSCs是一群呈成纖維細胞樣，有良好增殖能力，較低免疫原性，且具有多向分化潛能的細胞。經NRSF沉默與誘導培養(yǎng)基的