人胚胎干細(xì)胞向心室和心房肌細(xì)胞分化和富集的研究.pdf

1、心肌梗死是造成人類死亡的四大主要疾病之一,該疾病會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量缺失,進(jìn)一步導(dǎo)致病人死亡。由于成年化的心肌細(xì)胞不能分裂,具有不可再生性,因此,應(yīng)用心肌細(xì)胞移植治療心肌梗死已經(jīng)成為一個(gè)新的的研究熱點(diǎn)。
　　 近年來,隨著對(duì)人胚胎干細(xì)胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)的深入研究,使得應(yīng)用胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞治療心肌梗死成為可能。胚胎干細(xì)胞具有全能性,在體內(nèi)外特定的條件下,能定向分化為三個(gè)胚層

2、來源的各種類型的細(xì)胞,包括心肌細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞和胎兒形成早期的心肌細(xì)胞在電生理、鈣運(yùn)作、肌原纖維結(jié)構(gòu)和心肌收縮蛋白的表達(dá)等各個(gè)方面都有很大的相似性。然而,胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞存在異質(zhì)性,利用這種異質(zhì)的心肌細(xì)胞進(jìn)行移植,會(huì)導(dǎo)致心律不齊,因此,獲得純度較高的心肌細(xì)胞是進(jìn)行心肌細(xì)胞移植的前提條件。
　　 α肌球蛋白重鏈(alpha-myosin heavy chain,αMHC)在胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞初期特異性表

3、達(dá),并且其表達(dá)量隨分化時(shí)間的增加呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),而指導(dǎo)其特異性表達(dá)的是αMHC基因啟動(dòng)子。因此,αMHC基因的啟動(dòng)子能夠作為調(diào)控序列對(duì)胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,使其易于被識(shí)別和分離純化,從而進(jìn)行心肌細(xì)胞的移植治療。
　　 本研究的目的在于構(gòu)建含有心肌特異性啟動(dòng)子αMHC的滅瘟素(Blasticidin,簡(jiǎn)稱Blar)抗性基因以及綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基

4、因的慢病毒表達(dá)載體αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-neo,應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將慢病毒轉(zhuǎn)染至人胚胎干細(xì)胞,通過篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人胚胎干細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化為心肌細(xì)胞,進(jìn)一步分離純化胚胎干細(xì)胞源的心肌細(xì)胞。
　　 本研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1、重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定以及擴(kuò)增
　　 應(yīng)用PCR技術(shù)克隆出滅瘟素(Blar)抗性基因和口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus,FM

5、DV)的具有自剪切功能的多肽2A序列,2A序列能夠使同一啟動(dòng)子啟動(dòng)的多基因平衡表達(dá)。將Blar-2A片段插入慢病毒載體αMHC-EGFP-Rex-neo,構(gòu)建含有αMHC啟動(dòng)子的滅瘟素抗性基因以及綠色熒光蛋白基因的多順反子慢病毒表達(dá)載體αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-neo,通過酶切及測(cè)序鑒定后,對(duì)慢病毒載體進(jìn)行擴(kuò)增。將重組慢病毒載體與psPAX2、pMD2.G載體共同轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞,運(yùn)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)包裝出完整的重組

6、慢病毒。
　　 2、慢病毒轉(zhuǎn)染人胚胎干細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞株的獲得
　　 將獲得的慢病毒感染低代數(shù)的人胚胎干細(xì)胞,由于轉(zhuǎn)染后的人胚胎干細(xì)胞帶有人胚胎干細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子Rex,能啟動(dòng)新霉素(Neomycin,neo)抗性蛋白的表達(dá)。因此,用藥物G418篩選,能獲得轉(zhuǎn)染成功的人胚胎干細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下機(jī)械挑取單克隆細(xì)胞,并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)是否獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人胚胎干細(xì)胞,將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人胚胎干細(xì)胞命名為neo-hES

7、Cs。進(jìn)一步,對(duì)neo-hESCs進(jìn)行核型分析,經(jīng)過鑒定,轉(zhuǎn)染的人胚胎干細(xì)胞具有正常的二倍體核型,說明慢病毒轉(zhuǎn)染并不改變?nèi)伺咛ジ杉?xì)胞的核型,為進(jìn)一步從細(xì)胞水平探討特異性啟動(dòng)子介導(dǎo)的心肌細(xì)胞篩選純化奠定了基礎(chǔ)。
　　 3、體外誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞、藥物篩選及鑒定
　　 將neo-hESCs經(jīng)視黃酸信號(hào)通路直接誘導(dǎo)分化為心室肌細(xì)胞和心房肌細(xì)胞。誘導(dǎo)分化第10天,心肌細(xì)胞開始跳動(dòng)。提取分化第9天、10天、12天的心肌細(xì)胞RNA,反

8、轉(zhuǎn)錄為cDNA,檢測(cè)αMHC的表達(dá)情況。結(jié)果表明,分化第9天,心肌細(xì)胞即表達(dá)αMHC。于熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)有EGFP的表達(dá),并且表達(dá)區(qū)域呈現(xiàn)跳動(dòng)的狀態(tài),表明分化的心肌細(xì)胞表達(dá)EGFP。
　　 誘導(dǎo)分化第10天,用藥物滅瘟素篩選心肌細(xì)胞,每隔24小時(shí)更換含滅瘟素的心肌細(xì)胞培養(yǎng)基。加藥篩選的第3天,跳動(dòng)的心肌細(xì)胞開始聚團(tuán),非心肌細(xì)胞部分已經(jīng)死亡。篩選第4天,對(duì)照組中的細(xì)胞全部死亡,而實(shí)驗(yàn)組中存活的心肌細(xì)胞聚團(tuán)跳

9、動(dòng),將篩選后的心肌細(xì)胞命名為Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes。于熒光顯微鏡下觀察Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes,觀察到有EGFP表達(dá)。對(duì)Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes進(jìn)行心肌特異性肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T,cTnT)的免疫熒光染色,于熒光顯微鏡下觀察有cTnT的表達(dá),表明neo-hESCs分化的心肌細(xì)胞具有正常心肌細(xì)胞的典型特征。應(yīng)用FACS技

10、術(shù)篩選Blar-2A-EGFP-cardiomyocytes,鑒定其純度。篩選結(jié)果表明,心室肌細(xì)胞的純度達(dá)到95%,心房肌細(xì)胞的純度達(dá)到93%。
　　 進(jìn)一步,對(duì)心室肌細(xì)胞和心房肌細(xì)胞這兩種心肌細(xì)胞亞型做分子特征分析。IRX4(Iroquois homeobox protein4)是心室肌細(xì)胞特異性表達(dá)基因,能促進(jìn)心室肌細(xì)胞的發(fā)育。因此,本實(shí)驗(yàn)提取了篩選后的心室肌和心房肌細(xì)胞的RNA,通過Real time-PCR檢測(cè)兩者IRX