組織因子在人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)及調(diào)控的研究.pdf

1、在機(jī)體的發(fā)育過程中，基因的表達(dá)受到精確的調(diào)控。這種調(diào)控使基因按照機(jī)體發(fā)育的需要，表達(dá)呈現(xiàn)出特異的時(shí)間和空間特異性。近年來基因與蛋白的特異性表達(dá)已經(jīng)成為發(fā)育生物學(xué)中的研究熱點(diǎn)。組織因子(Tissue factor,TF)，又稱為凝血因子Ⅲ、CD142，是由263個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜單鏈糖蛋白，在體內(nèi)廣泛表達(dá)，其在許多重要的生理及病理情況下，特別是維持機(jī)體凝血平衡和保護(hù)重要臟器方面具有重要作用。血栓與止血平衡是發(fā)育過程中最重要的穩(wěn)態(tài)之一。

2、在血細(xì)胞形成之前，由滋養(yǎng)層細(xì)胞(Trophoblast)表達(dá)的大量TF使胚胎穩(wěn)定，在防止流產(chǎn)和妊娠大出血方面有重要意義。在血細(xì)胞形成后，TF在不同的血細(xì)胞中表達(dá)水平不同，其具體調(diào)控機(jī)制目前尚未明確。人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）由于其維持自我干細(xì)胞特性及多向分化潛能的特性，成為我們研究基因時(shí)間和空間特異性表達(dá)的良好模型。
　　miRNA是一類約17-24個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子RN

3、A?，F(xiàn)在已知miRNAs這些微小的RNAs控制著許多重要的生理或病理過程。而Akt和Erk1/2在包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中起重要作用。
　　在本實(shí)驗(yàn)中我們以人類胚胎干細(xì)胞為體外模型，分化成造血細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞，檢測不同分化階段細(xì)胞中TF的表達(dá)水平的變化。并進(jìn)一步探討在分化過程中，miRNA及Erk1/2對TF表達(dá)的調(diào)控。本研究分為以下三個(gè)部分:
　　第一部分:組織因子在人胚胎干細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化

4、　　目的:建立有效的人胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠地細(xì)胞標(biāo)本。檢測分化過程中不同階段TF的表達(dá)水平。
　　方法:①將人胚胎干細(xì)胞（hESCs）誘導(dǎo)分化出造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs)及滋養(yǎng)層細(xì)胞;②將造血干/祖細(xì)胞分化為粒-單細(xì)胞及紅細(xì)胞;③流式細(xì)胞學(xué)檢測造血細(xì)胞特異性標(biāo)記，RT-PCR檢測滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性標(biāo)記;④磁珠分選CD

5、34+，或CD14+，或CD15+細(xì)胞，檢測TF(CD142)表達(dá)水平;⑤qPCR，RT-PCR及Western blot檢測TF的mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:①人胚胎干細(xì)胞(hESCs)與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(OP9)共培養(yǎng)第8天，流式細(xì)胞學(xué)檢測CD34+細(xì)胞比例達(dá)到17.2％，磁珠分選后，流式細(xì)胞學(xué)檢測TF表達(dá)為陰性;②添加不同細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)粒-單細(xì)胞及紅細(xì)胞，磁珠分選后檢測TF表達(dá)，發(fā)現(xiàn)粒-單細(xì)胞TF表達(dá)呈陽性，紅細(xì)

6、胞TF表達(dá)呈陰性;③RT-PCR檢測BMP4方法誘導(dǎo)分化第0天、第2天、第5天的滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)第0天可見OCT-4、Nanog表達(dá);培養(yǎng)第5天可見滋養(yǎng)層特異性基因CDX2表達(dá)，TF表達(dá);④粒-單細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞TF的mRNA和蛋白水平有表達(dá)，而人胚胎干細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞、紅細(xì)胞TF不表達(dá)。
　　結(jié)論:我們通過有效地人胚胎干細(xì)胞向造血細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系，發(fā)現(xiàn)粒-單細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的TF有表達(dá)，而人胚胎干細(xì)胞、造血干/

7、祖細(xì)胞、紅細(xì)胞不表達(dá)TF。
　　第二部分:miRNA在組織因子表達(dá)過程中的調(diào)控作用
　　目的:研究miRNA在TF表達(dá)過程中是否起調(diào)控作用。
　　方法:①檢測人胚胎干細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞、粒-單細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞miRNA表達(dá)譜;②進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定候選miRNA為miR-19a，miR-20b，miR-106a，miR-223;③檢測人胚胎干細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞、粒-單細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞中候選miRNA的表達(dá)

8、;④構(gòu)建正常及突變的TF-3' UTR，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測TF的表達(dá)水平;⑤將miR-20b的抑制劑及TF-3'UTR轉(zhuǎn)入細(xì)胞，檢測其對TF表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:①人胚胎干細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞、粒-單細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)譜檢測差異性表達(dá)的miRNA;②使用Targetscan及miRBase軟件，生物信息學(xué)分析篩選其中結(jié)構(gòu)最可能與TF-3'UTR結(jié)合的miRNAs;③篩選其中表達(dá)差異最大的miR-19a，miR-20b，

9、miR-106a，miR-223進(jìn)行qPCR驗(yàn)證;④雙熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)miR-20b對TF的表達(dá)有調(diào)控作用;⑤將miR-20b的抑制劑及TF-3'UTR轉(zhuǎn)入細(xì)胞，檢測其對TF表達(dá)水平的影響，驗(yàn)證miR-20b的調(diào)控作用。
　　結(jié)論:miR-20b在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控TF的表達(dá)，抑制miR-20b的作用可使TF的表達(dá)水平升高。
　　第三部分:Erk1/2在組織因子表達(dá)過程中所起的調(diào)控作用
　　目的:研究Erk1/2、

10、Akt在TF表達(dá)過程中是否有調(diào)控作用。
　　方法:①檢測人胚胎干細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞、粒-單細(xì)胞、紅細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞Erk1/2和Akt的表達(dá)水平;②將Erk1/2的抑制劑，即U0126，加入粒-單細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞，qPCR和Western blot檢測細(xì)胞表面標(biāo)記PU.1、CDX2及TF的mRNA和蛋白表達(dá)水平;③將U0126及miR-20b的抑制劑同時(shí)加入粒-單細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞，qPCR檢測細(xì)胞表面標(biāo)記及TF的mRNA表達(dá)水平

11、。
　　結(jié)果:①檢測人胚胎干細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞、粒-單細(xì)胞、紅細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞Erk1/2和Akt，發(fā)現(xiàn)Erk1/2表達(dá)與TF表達(dá)相關(guān)，而Akt則沒有;②將U0126加入粒-單細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞，TF的mRNA及蛋白水平均下降，而細(xì)胞表面標(biāo)記沒有發(fā)生變化;③將U0126及miR-20b的抑制劑同時(shí)加入粒-單細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞，qPCR檢測細(xì)胞表面標(biāo)記未發(fā)生變化。發(fā)現(xiàn)同時(shí)加miR-20b抑制劑和U0126組，表達(dá)水平高于單獨(dú)加U012