NLS和DMSO提高核糖體區(qū)打靶載體轉(zhuǎn)染效率的研究.pdf

1、非病毒載體因為安全性好、操作簡便、免疫原性低等方面而優(yōu)于病毒載體。但是較低的轉(zhuǎn)染效率和治療基因的短暫表達嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。我室構(gòu)建的人核糖體區(qū)打靶載體pHrneo，可以高效定點整合到rDNA區(qū)（定點整合率10-5-10-4）而使外源基因得到長期的表達。人皮膚成纖維細胞（human dermal fibroblast，HDF）因為易于操作和培養(yǎng)而成為ex vivo基因治療策略中的理想靶細胞，但是較低的轉(zhuǎn)染效率，限制了其在臨床基因治療研

2、究中的應(yīng)用。當(dāng)質(zhì)粒較大時（一般超過10kb，MW>700KD），其在細胞質(zhì)中被阻滯的時間就會越長，轉(zhuǎn)染率也會迅速下降。攜帶治療基因的重組pHrneo質(zhì)粒一般為10-16kb，細胞質(zhì)及核膜的阻滯作用是其轉(zhuǎn)染效率低下的重要原因。 目的：為提高人核糖體區(qū)打靶載體的轉(zhuǎn)染效率，我們采用了兩種策略促進質(zhì)粒DNA（pDNA）進入細胞核，以降低細胞質(zhì)及核膜阻滯對轉(zhuǎn)染效率的影響：1）核定位信號（nuclear location signal，N

3、LS）促進質(zhì)粒DNA快速進入細胞核，使其在被細胞質(zhì)中核酸酶降解之前得以表達，從而達到提高轉(zhuǎn)染效率的目的；2）兩親性小分子可以干擾核孔復(fù)合體的疏水結(jié)構(gòu)，從而打破核膜障礙，促進質(zhì)粒DNA進入細胞核，提高轉(zhuǎn)染效率。 方法：1）：利用NLS與重組pHrneo質(zhì)粒通過靜電作用結(jié)合，0.6％瓊脂糖凝膠阻滯實驗檢測偶聯(lián)效果；DNase I模擬細胞質(zhì)內(nèi)的核酸酶酶切，評價NLS對pDNA的保護作用；不同偶聯(lián)比例的NLS/pHrnGFP復(fù)合物利用

4、聚乙烯亞胺（PEI）法轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞，48小時后流式細胞儀檢測GFP表達效率；轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記pHrnGFP后1小時，激光共聚焦顯微鏡檢測質(zhì)粒的亞細胞位置。2）DMSO預(yù)處理HDF后Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染pHrnGFP，24小時后流式細胞儀檢測GFP表達效率；流式細胞儀分析DMSO處理對HDF的細胞周期的影響；轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記pHrnGFP后30分鐘，激光共聚焦顯微鏡檢測質(zhì)粒的亞細胞位置。MTT實驗評價NLS及DMSO

5、對HDF的細胞毒性。 結(jié)果：1）瓊脂糖凝膠實驗顯示NLS與pDNA偶聯(lián)后可以降低其在凝膠中的遷移速度；當(dāng)NLS/pHrnGFP偶聯(lián)比例大于2×104時，可以在一定程度上防止DNase I的降解，并顯著提高人核糖體區(qū)打靶載體pHrnGFP的轉(zhuǎn)染效率4-5倍。激光共聚焦顯微鏡觀察NLS可以促進pHrnGFP在1小時內(nèi)進入細胞核。2）應(yīng)用2％DMSO預(yù)處理HDF48小時后，再采用Lipofectamine2000法進行轉(zhuǎn)染，可以顯著

6、提高pHrnGFP的轉(zhuǎn)染效率2-3倍；DMSO處理后90％的HDF阻滯在G1期，除去DMSO后HDF繼續(xù)增殖；激光共聚焦顯微鏡下觀察，pHrnGFP可以在30分鐘內(nèi)進入DMSO處理細胞的細胞核。 結(jié)論：NLS可以促進人核糖體區(qū)打靶載體快速進入細胞核，并顯著提高核糖體區(qū)打靶載體轉(zhuǎn)染HDF的效率。應(yīng)用2％ DMSO預(yù)處理HDF48小時，可以有效干擾核孔復(fù)合體的疏水結(jié)構(gòu)，顯著提高核糖體區(qū)打靶載體的轉(zhuǎn)染效率。兩種方法為核糖體區(qū)打靶載體