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文檔簡介
1、核糖體基因(rDNA)區(qū)可能是一個安全有效的基因打靶區(qū)域,我室基于此開發(fā)的非病毒人源基因載體系統(tǒng)--核糖體基因區(qū)靶向載體,能攜帶多種治療基因在多種細胞系中成功打靶rDNA18S區(qū)+5468位點,且外源基因能長期穩(wěn)定地表達。進一步提高rDNA區(qū)的打靶效率可以更充分地發(fā)揮該區(qū)域作為基因治療靶位點的潛能,尤其在打靶病人來源的原代細胞方面帶來突破。近年來,鋅指酶作為提高基因打靶效率的有力工具被廣泛應(yīng)用,甚至能將打靶效率提高5000倍以上。我室針
2、對rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔1(ITS1)區(qū)+6523-+6546位點設(shè)計的鋅指酶ZFN-S3,體內(nèi)體外實驗檢測均表明其具有較高的切割雙鏈DNA的活性。ZFN-S3可能是用于提高rDNA區(qū)打靶效率有效工具。
目的:針對ZFN-S3的切割位點設(shè)計、構(gòu)建核糖體基因區(qū)鋅指酶位點靶向載體--pHr1-NL、pHr2-NL,證實該載體打靶rDNA區(qū)的可行性,為該載體聯(lián)合鋅指酶ZFN-S3高效打靶rDNA區(qū)奠定基礎(chǔ)。
方法:載
3、體pHr1-NL的構(gòu)建:首先用PCR法克隆約2kb的rDNA同源序列。然后將無啟動子但5’端有EMCV-IRES序列的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neo)基因亞克隆至同源序列的rDNA ITS1區(qū),利用“啟動子陷阱”策略富集同源重組子。并在Neo基因兩側(cè)加入同向的loxP位點,用于后續(xù)的特異性基因刪除。載體pHr2-NL的構(gòu)建:將pHr1-NL上rDNA+5513-+6523的同源序列替換成rDNA+937-+6523同源序列。將構(gòu)建好的載體pH
4、r1-NL、pHr2-NL利用核轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染人類纖維肉瘤(HT1080)細胞,通過篩選、挑取和計數(shù)細胞克隆、鑒定定點整合等步驟,對其rDNA區(qū)的打靶進行研究。
結(jié)果:1、構(gòu)建的載體pHr1-NL經(jīng)EcoRⅤ、ClaⅠ酶切鑒定,所獲得的酶切片段大小與理論值相符。2、構(gòu)建的載體pHr2-NL經(jīng)EcoRⅤ、AatⅡ酶切鑒定,所獲得的酶切片段大小與理論值相符。3、載體pHr1-NL、pHr2-NL的測序結(jié)果與理論序列相符。4、采用
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