胚胎干細胞自我更新和分化研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 miR23a～27a～24在胚胎干細胞分化中的功能研究
　　了解胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)維持自我更新及多向分化潛能的具體機制，對于人們未來更好的將其應用于再生醫(yī)學非常重要。過去幾十年已經(jīng)對ESC中轉錄因子和信號通路層面上的調(diào)控機制開展了較全面的研究，也勾畫出ESC維持其特征的具體整體框架。除了各種轉錄因子相互協(xié)調(diào)形成網(wǎng)絡調(diào)控外，人們也逐漸認識到

2、表觀遺傳修飾，如組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼RNA等，也可以協(xié)同轉錄調(diào)節(jié)因子來共同維持ESC狀態(tài)基因的表達。其中microRNA在ESC自我更新及分化中發(fā)揮了重要的功能，在ESC中將Dicer和DGCR8敲除均顯示ESC分化存在缺陷，說明microRNA在胚胎干細胞的自我維持尤其是分化中具有非常關鍵的作用。人們對于促進ESC自我更新和多潛能性，提高iPS細胞重編程效率的microRNA研究較多。但是，對于抑制ESC自我更新，促進分化

3、的microRNA則研究較少。
　　本課題組在前期的研究工作發(fā)現(xiàn)位于小鼠8號染色體上的miR-23a～27a～24-2基因簇（miR-23a基因簇）的兩個成員miR-27a和miR-24在分化細胞和組織中呈現(xiàn)不同程度的高表達，通過靶基因Oct4、Foxo1、gp130、Smad3、Smad4實現(xiàn)對ESC自我更新的抑制，并能夠促ESC多胚層分化，抑制二者的表達能顯著提高三因子介導的iPS細胞形成的效率，同時有促進胚層特異性分化的相關

4、報道?？紤]到上述工作很多是在特定修飾的細胞系或者體外開展，對miR-27a和miR-24-2在ESC分化中是否不可或缺這一問題不能全面回答，miR-23基因家族除了miR-23a基因簇外，還包含有位于13號染色體上的miR-23b～27b～24-1基因簇（簡稱miR-23b基因簇），這兩個基因簇共編碼5個microRNA: miR-23a，23b，27a，27b，24。miR-23b基因簇上三個成員miR-23b，27b，24-1的種子

5、序列與miR-23a基因簇中的三個成員完全相同，因此它們可能具有相同的靶基因及相應的功能，在功能上有代償作用。因此，使用CRISPR/Cas9技術在V6.5細胞系中分別獲得miR-23a和23b雙基因簇純合敲除(DKO)和miR-23a基因簇純合敲除(KO)細胞系，而這是第一次由CRISPR/Cas9技術實現(xiàn)雙microRNA基因簇的純合敲除。而后，將獲得DKO和KO ESC系通過EB形成實驗、ES細胞向中內(nèi)胚層定向誘導實驗和畸胎瘤形成

6、實驗確定上述miR-23a/b基因簇敲除ESC系的分化能力。在EB形成實驗中，DKO細胞顯示導致中胚層分化缺陷而促進其它胚層的分化，提示miR-23～27～24基因簇參與ESC自我更新的抑制和早期中胚層的形成;在心肌分化實驗中，DKO ESC在任意天數(shù)都未觀察到博動性cEBs，心肌特異標志物Nkx2.5、Tbx5、a-MHC、b-MHC和cTnT等的表達量明顯降低。免疫熒光試驗顯示沒有明顯的肌原纖維形態(tài)，三個心肌標志物Actinin、A

7、NP和Troponin1的表達量也非常低，提示miR-23～miR-27～miR-24基因簇在心肌細胞分化中起著非常重要的作用;同過畸胎瘤體積大小和重量檢測顯示DKO ESC成瘤能力小于KO和野生型ESC，通過HE染色，DKO ESC來源的畸胎瘤中可以觀察到外、內(nèi)胚層的結構，而幾乎沒有中胚層的結構，并且存在大量未分化或低分化的區(qū)域;通過ESC的標志物Oct4進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)DKO ESC來源的畸胎瘤中存在大片Oct4染色陽性區(qū)域，

8、而野生型ESC來源的畸胎瘤中則幾乎沒有，KO ESC來源的畸胎瘤介于兩者之間。
　　第二部分 單倍體胚胎干細胞突變體文庫的建立和應用
　　研究表明轉錄因子Oct4與Sox2是維持多能性所必須的，它們與其它一些轉錄因子共同組成了一個調(diào)控網(wǎng)絡來建立及維持ESC的多能性。當這一調(diào)控網(wǎng)絡被破壞時，ESC將退出多能性(Exit from Pluripotency)走向分化，但是，對于這一過程的機制，還有很多疑問有待人們研究，目前在國際

9、上已經(jīng)有幾個研究團隊利用正向遺傳學篩選(Forward Genetics)方法獲得了與調(diào)控ESC退出多能性相關的候選基因。但這些研究都有自身的局限性，另外，將這些遺傳篩選的結果放在一起分析會發(fā)現(xiàn)相互間的重復性很差，只有少數(shù)幾個基因（如Tcf3）在不同研究中都被篩選出來，這也從側面說明上述研究還遠沒有全面揭示ESC退出多能性進入分化狀態(tài)的相關因子及其作用機制。
　　由于多數(shù)基因的性狀為隱性的，只有兩個等位基因都發(fā)生突變時，性狀的變化

10、才顯現(xiàn)出來，因此獲得基因組范圍的純合突變細胞文庫是進行正向遺傳篩選研究必要條件。haESC只具有一套染色體組，并具有ESC的所有特征，因而，在正向遺傳篩選工作具有更廣泛的優(yōu)勢，目前，在突變ESC基因的多種方法中，利用病毒載體和轉座子載體進行的插入突變是使用較為廣泛的方法，而轉座子載體沒有病毒載體那樣顯著的基因組整合偏好性，可以覆蓋更多的基因。因此使用piggyBac轉座子載體攜帶的基因誘捕(Gene Trap)元件在haESC中構建了4

11、個純合突變體文庫，約包含60000個突變克隆，通過Southern blot檢測其轉座子單拷貝插入插入的比例在74％，通過Splinkerette-PCR結合“三引物競爭性PCR”鑒定純合突變的比例在85％以上，通過Splinkerette-PCR結合高通量測序的方法確定構建的文庫中55％以上的插入位點位于基因內(nèi)，其約涵蓋18000個以上的基因。在此基礎上，構建了一個包含460個突變克隆的小規(guī)模矩陣式突變體文庫，所謂“矩陣庫”就是在單倍

12、體胚胎干細胞混合庫的基礎上，將每一個突變克隆挑取到96孔細胞培養(yǎng)板中獨立培養(yǎng)。隨后利用兩種分化條件M15(-LIF)和N2B27對這些細胞進行了分化篩選，共獲得了33個仍可以呈ESC樣生長的陽性克隆;利用Splinkerette PCR結合常規(guī)測序確定了19個陽性克隆在基因組中的插入位點，其中11個插入位點定位于已知基因，包含已知的與分化和發(fā)育相關的基因。接著，挑選了兩個陽性克隆進行回復實驗，當轉座子捕獲載體被切除后，回復克隆在分化的條