胚胎干細(xì)胞基因在晶狀體上皮中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)的分化表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、在整個(gè)生命過(guò)程中,晶狀體上皮細(xì)胞(Lens epithelial cells,LECs)幾乎都在持續(xù)進(jìn)行分裂,其子細(xì)胞不斷從晶狀體的生殖區(qū)遷移到赤道區(qū)、延伸,最后分化為晶狀體纖維。我們以前的研究表明在兔晶狀體中央?yún)^(qū)上皮細(xì)胞中可能存在晶狀體干細(xì)胞,故本研究目的之一是進(jìn)一步證實(shí)我們之前的結(jié)論。因此,作者以6月齡以下家兔為實(shí)驗(yàn)材料,分離其晶狀體中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)上皮細(xì)胞,并分別將其用于體外原代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分

2、析,其主要結(jié)果如下:
   1、不同區(qū)域的晶狀體上皮細(xì)胞均能在體外培養(yǎng)成功;
   2、RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果均表明胚胎干細(xì)胞基因CD9和SOX2在原代培養(yǎng)的晶狀體中央?yún)^(qū)上皮細(xì)胞中表達(dá)比在周邊區(qū)明顯強(qiáng)烈,差異顯著。此結(jié)果進(jìn)一步支持了晶狀體中央?yún)^(qū)可能存在晶狀體干細(xì)胞這一推論。
   另一方面,眾所周知晶狀體上皮細(xì)胞是通過(guò)一個(gè)自我消除其細(xì)胞器等一系列過(guò)程而分化為晶狀體纖維。而脫氧核糖核酸限制性內(nèi)切酶DLAD(

3、DNaseⅡ-like acid DNase,似二型脫氧核糖核酸酶)在晶狀體上皮細(xì)胞的分化過(guò)程中對(duì)晶狀體纖維的去核化起重要作用。編碼DLAD蛋白的基因已被克隆,可是當(dāng)時(shí)市場(chǎng)上尚無(wú)DLAD抗體出售,因此妨礙了對(duì)DLAD的功能進(jìn)行研究。為使后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌归_(kāi),本論文的另一部分內(nèi)容則為準(zhǔn)備用于研究晶狀體上皮細(xì)胞分化的抗體——小鼠DLAD(mouse DLAD,mDLAD)多克隆抗體。為此,我首先制備并純化了一種本實(shí)驗(yàn)室正積極研究的在脊椎動(dòng)物眼

4、睛和其它組織中起重要作用的蛋白——絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A催化亞基β(PP-2Acβ)的GST融合蛋白。以此融合蛋白為抗原,成功制備了識(shí)別視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE)中內(nèi)源性PP-2A的抗血清。在此成功制備抗體的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上,我積極準(zhǔn)備制備DLAD多克隆抗體。然而,通過(guò)一系列研究我發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)和方法幾乎不可能在原核中誘導(dǎo)表達(dá)mDLAD基因。其中部分原因可能為DLAD編碼的是一核酸內(nèi)切酶,外源性表達(dá)該酶其可能會(huì)降解宿主DNA,因此宿主通過(guò)

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