簡介：EB病毒感染與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前，我國缺乏關(guān)于人群EB病毒感染，尤其是兒童初次感染的血清流行病學(xué)資料而了解兒童感染EB病毒的概貌，對于病毒學(xué)基礎(chǔ)研究、EB病毒相關(guān)疾病的治療和預(yù)防等，都具有參考意義。本研究以2013年1月3月在北京協(xié)和醫(yī)院就診，且進(jìn)行過任意一種血清學(xué)檢查的09歲兒童作為研究樣本，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA的方法檢測EB病毒的4種標(biāo)記性抗體，即抗VCAVIRALCAPSIDANTIGENIGM及IGG抗體、抗EAEARLYANTIGENIGG抗體和抗NANUCLEARANTIGENIGG抗體，所測抗體的結(jié)果構(gòu)成了研究樣本的抗體譜。這種聯(lián)合檢測抗EB病毒抗體譜的實(shí)驗方法在國內(nèi)并不多見，在北京地區(qū)則為首次采用。由抗體譜的結(jié)果將所有研究樣本區(qū)分為急性感染、既往感染和未感染三大類，按照年齡分布，統(tǒng)計了各年齡組的陽性率。除此以外，本研究還提取了研究樣本的血清游離DNA，通過實(shí)時熒光定量PCR的方法檢測了EB病毒DNA的陽性率和陽性標(biāo)本的DNA拷貝數(shù)。研究結(jié)果顯示，在所有754份符合設(shè)定要求的研究樣本中，有583例801％樣本的抗體譜提示EB病毒感染，其中急性感染和既往感染分別有65例892％和518例712％。在年齡分布上，根據(jù)抗VCAIGM抗體的結(jié)果（該抗體不會經(jīng)過胎盤從母體進(jìn)入嬰兒體內(nèi)），并結(jié)合DNA檢測的結(jié)果，0歲06M的感染陽性率為0根據(jù)4種抗體的抗體譜結(jié)果，從0歲711M，423％起到9歲919％的感染陽性率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，其中從0歲711M到2歲是增長率最快的階段而感染陽性率在8歲年齡組首次超過90％，達(dá)到與成年人相當(dāng)?shù)乃健⒖家酝愃频难芯抠Y料，將本研究提示的感染陽性率與北京地區(qū)20世紀(jì)70年代及2006年的數(shù)據(jù)結(jié)合分析，其感染高峰呈現(xiàn)出延后的趨勢，逐漸向發(fā)達(dá)國家的感染高峰靠近，與我國現(xiàn)階段的經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展水平相符合。在754份研究樣本中，血清病毒DNA陽性的樣本為39例，占517％，明顯低于抗體譜的陽性率。由于血清EB病毒DNA僅在病毒活躍復(fù)制時才能檢測到，使用實(shí)時熒光定量PCR的方法檢測血清病毒DNA拷貝數(shù)更適合于在具有一定感染風(fēng)險的患兒中進(jìn)行EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷或評價疾病的嚴(yán)重性時使用。在以無癥狀的病毒攜帶者為主要人群的正常人中進(jìn)行篩查，其對病毒感染狀態(tài)的提示意義是較為有限的。

簡介：碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼10023學(xué)號2011003021探討中國婦女宮頸腺癌人乳頭瘤病毒感染及組織學(xué)特征HISTOLOGICALCHARACTERISTICSANDHUMANPAPILLOMAVIRUSINFECTIONINCERVICALADENOCARCINOMAOFCHINESEWOMEN所院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院姓名劉瀟陽指導(dǎo)教師張詢導(dǎo)師小組張宏圖、石素勝學(xué)科專業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)研究方向?qū)m頸腺癌完成日期2014年5月北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院表索弓表表表表表5表6表7表8表9表10表11表12表13表14表15表16表17表18表19表20表21表22表23表索引571例宮頸腺癌亞型構(gòu)成情況15不同亞型宮頸腺癌平均發(fā)病年齡情況16三種不同宮頸癌P16染色結(jié)果比較17不同亞型宮頸腺癌P16染色結(jié)果比較17三種不同宮頸癌PR染色結(jié)果比較18不同亞型宮頸腺癌PR染色結(jié)果比較18不同亞型宮頸癌VIMENTIN染色結(jié)果比較19HPV單一型別和多重感染病例分布1920例合并CIN病例HPV感染分布2L宮頸癌合并CIN與HPV感染情況一21HPV感染與發(fā)病年齡的關(guān)系22宮頸腺癌合并CIN與HPV感染情況一23宮頸腺癌HPV感染與發(fā)病年齡的關(guān)系24宮頸腺癌不同亞型HPV分布情況24宮頸腺癌不同亞型HPV感染與年齡關(guān)系25宮頸腺癌不同亞型HPV陽性病例HPV分布情況26宮頸腺鱗癌中HPV單一型別和多重感染分布29宮頸腺鱗癌HPV感染與發(fā)病年齡的關(guān)系29三類宮頸癌HPV感染情況比較30P16染色結(jié)果與HPV檢測結(jié)果關(guān)聯(lián)性分析30子宮與宮頸不同組織子宮內(nèi)膜樣腺癌比較3151例HPV多重感染的宮頸癌LCM結(jié)果3254例單一型別HPV感染宮頸管型腺癌顯微切割結(jié)果34

簡介：點(diǎn)擊查看更多慢病毒介導(dǎo)的TGF-β3、CTGF、TIMP1聯(lián)合轉(zhuǎn)染兔退變椎間盤的生物學(xué)效應(yīng).pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點(diǎn)擊查看更多漢坦病毒囊膜糖蛋白G1與核蛋白部分片段在昆蟲細(xì)胞中的融合表達(dá)及免疫學(xué)特性研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文天津地區(qū)嬰幼兒諾如病毒感染的分子流行病學(xué)特征姓名王瑞雪申請學(xué)位級別碩士專業(yè)臨床檢驗診斷學(xué)指導(dǎo)教師彭林20100501天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文BEIJIN9361株，BEIJIN9310株同源性較高；序列TJC0809與2006年日本的AKITAL同源性較高；序列TJC0903，TJC0905與2007年北京的BEIJIN9133株同源性較高；序列TJC0906與2007年的BEIJIN996株，AEIJINGL0株同源性較高。除序列TJC0904外，其它14株核苷酸序列均于GII4／2006B相近，而TJC0904與2008年韓國SEOUL0229株同源性較高，為重組病毒。3NV檢測陽性的患兒中出現(xiàn)嘔吐的患兒為26例，占所有NV感染患兒的1494％。發(fā)熱9例，占NV檢測陽性患兒的517％。糞便性狀中蛋花樣糞便84例，占4828％，稀糊樣糞便51例，占2931％，稀水樣糞便39例，占2241％。腹瀉平均持續(xù)449天。在檢測的12個月中，2008年11月的檢出率最高，為6222％，其次為2009年2月，檢出率為5200％。2009年6月亦有小高峰，檢出率為3962％。2008年8月檢出率最低，為1250％。在NV檢測陽性的患兒中，1217月年齡組的患兒所占比例最高，為2993％，其次為35月，911月年齡組，各占NV陽性患兒的1897％。2歲以下患兒占8736％。在本次檢測中，男性患兒的檢出率為3294％，女性患兒的檢出率為3100％D差別無統(tǒng)計學(xué)意義。4檢測NV的引物P289／290檢出率為2133％，引物JVL2Y／JVL3I的檢出率為1741％。二者差別有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論2008年8月至2009年7月，天津地區(qū)嬰幼兒病毒性腹瀉中，諾如病毒是主要的病原體之一。主要流行的基因型為GII4型。主要感染2歲以下的嬰幼兒。一年中各月均有NV陽性標(biāo)本檢出，其中11月為發(fā)病高峰。引物P289／290對NV的檢出率高于引物JV12Y／JVL3I。關(guān)鍵詞病毒性腹瀉諾如病毒RTPCR序列分析基因型臨床癥狀I(lǐng)I

簡介：背景2012年6月在一位沙特阿拉伯人身上首次發(fā)現(xiàn)一種類似于急性嚴(yán)重呼吸綜合征冠狀病毒SEVEREACUTERESPIRATYSYNDROMESARSCOV的病毒隨即其便證明并命名為中東呼吸道綜合征冠狀病毒DLEEASTRESPERATYSYNDROMEMERSCOV。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計截止2014年2月28日MERSCOV已感染184例其中80例死亡死亡率近45％。MERSCOV基因組由正義、單鏈RNA組成且其編碼的兩個大復(fù)制酶多聚蛋白PP1A和PP1AB主要是由基因組前23部分翻譯得到。PP1A和PP1AB被木瓜樣蛋白酶PAPAINLIKEPROTEASEPLPRO和3C樣蛋白酶CHYMOTRYPSINLIKEPROTEASE3CLPRO切割成16個非結(jié)構(gòu)蛋白NSP116。NSP116經(jīng)過組裝產(chǎn)生一個多功能、膜結(jié)合且可以介導(dǎo)完成病毒基因組復(fù)制和結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的復(fù)制酶聚合體REPLICASECOMPLEXRC。區(qū)別于已知大多數(shù)編碼兩個木瓜樣蛋白酶PLP1和PLP2的冠狀病毒是MERSCOV僅編碼一個木瓜樣蛋白酶PLPRO。MERSNSP3編碼7個小的功能結(jié)構(gòu)域其中以PLPRO為核心且PLPROC端TM跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⑵涠ㄎ挥谀ど?。MERSCOV感染出現(xiàn)后其便成為醫(yī)學(xué)界研究的焦點(diǎn)和生物學(xué)界研究熱點(diǎn)之一本實(shí)驗室率先針對MERSCOV蛋白酶的結(jié)構(gòu)學(xué)特征和生物學(xué)功能展開深入研究。目的以人類MERSCOV帶跨膜結(jié)構(gòu)域的木瓜樣蛋白酶PLPROTM為研究對象MERSPLPRO高級結(jié)構(gòu)、具體生物學(xué)功能以及其對宿主細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá)調(diào)控的研究為進(jìn)一步探究人類新冠狀病毒MERS的致病機(jī)理提供理論依據(jù)和新抗病毒藥物的研發(fā)提供靶點(diǎn)。方法首先人工合成MERSCOVPLPROTM和各個酶切底物NSP12NSP23和NSP34。其次利用PCR技術(shù)克隆得到不含跨膜結(jié)構(gòu)域的MERSPLPRO并利用PCR定點(diǎn)突變試劑盒將PLPROTMPLPRO蛋白酶催化活性中心CYSHISASP分別突變?yōu)锳LA從而構(gòu)建出三種酶活性缺失突變體同時構(gòu)建出各個蛋白酶酶切底物的LXGGA相應(yīng)突變體。最后利用蛋白印跡法、雙熒光素酶報告基因和免疫熒光染色技術(shù)檢測MERSPLPROTM的生物學(xué)功能及其對宿主細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá)調(diào)控。對其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究首先利用WESTERNBLOT技術(shù)檢測MERSCOVPLPROTM對不同蛋白酶底物的切割情況并利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建PLPROTMPLPRO酶活性突變體及蛋白酶底物點(diǎn)突變體利用WESTERNBLOTTING技術(shù)檢測突變體對PLPROTM酶活性影響及突變體對蛋白酶底物切割的影響。其次雙熒光素報告基因檢測MERSPLPROTMPLPRO及其蛋白酶催化活性突變體對宿主細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá)調(diào)控WESTERNBLOTTING檢測MERSPLPROTM對細(xì)胞內(nèi)IRF3磷酸化水平影響間接免疫熒光技術(shù)檢測MERSPLPROTM對細(xì)胞內(nèi)IRF3入核活化的影響情況。最后WESTERNBLOTTING檢測MERSPLPROTMPLPRO對細(xì)胞內(nèi)泛素化水平的影響。結(jié)果1MERSPLPROTM高級空間結(jié)構(gòu)研究以SARSPLPRO蛋白酶為預(yù)測模板利用生物信息學(xué)預(yù)測MERSPLPRO高級空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示MERSCOVPLPRO與SARSCOVPLPRO及兩者的蛋白酶催化活性位點(diǎn)的高級空間結(jié)構(gòu)存在一定程度的相似性。2MERSPLPROTM特異性地切割釋放底物蛋白在HEK293T細(xì)胞中MERSPLPROTM可以完全切割釋放蛋白酶底物NSP23部分切割釋放底物NSP12和NSP34。分別突變MERSPLPROTM的各個蛋白酶催化活性中心后發(fā)現(xiàn)各個蛋白酶底物的切割釋放產(chǎn)物量均有所降低。此外實(shí)驗結(jié)果顯示當(dāng)?shù)孜锏鞍酌傅母叨缺Ｊ匦蛄斜煌蛔兒驪LPROTM對底物蛋白酶的切割釋放明顯減弱。提示MERSCOVPLPROTM特異性識別并切割底物蛋白酶的高度保守序列且此切割作用受PLPROTM蛋白酶催化活性位點(diǎn)影響。3MERSPLPROTM是人類冠狀病毒編碼的一種新IFN拮抗蛋白在HEK293T細(xì)胞中MERSPLPROTM及其一系列蛋白酶活性突變體均可抑制RIGIN介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá)并通過破壞細(xì)胞內(nèi)IRF3磷酸化進(jìn)而破壞IRF3通路的活化暗示著MERSCOVPLPROTM主要通過破壞細(xì)胞內(nèi)IRF3通路的活化從而抑制干擾素表達(dá)。4MERSPLPROTM是人類冠狀病毒編碼的一種新DUB酶將泛素分子HAUBHAUBK48HAUBK63分別與MERSPLPROPLPROTM基因共同轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)MERSPLPROPLPROTM能有效地去除細(xì)胞內(nèi)泛素化修飾的蛋白包括K63、K48修飾的泛素化從而證實(shí)MERSPLPROTMPLPRO具有細(xì)胞內(nèi)DUB活性且PLPRO的DUB活性存在蛋白酶催化活性依賴性然而MERSPLPROTM不存在此種依賴性。提示MERSPLPRO的蛋白酶活性與其DUB活性存在必然聯(lián)系且MERSPLPROTM的DUB活性呈現(xiàn)一定程度的TM依賴性。結(jié)論MERSCOV編碼的木瓜樣蛋白酶PLPROTM通過識別高度保守序列LXGG完成對蛋白酶底物的特異性切割且此活性主要依賴于其蛋白酶催化活性中心同時MERSCOVPLPRO是一種新的干擾素拮抗蛋白其可能通過破壞細(xì)胞內(nèi)IRF3的磷酸化并阻斷其入核從而抑制細(xì)胞內(nèi)干擾素的表達(dá)此外MERSPLPROTM能夠有效去除細(xì)胞內(nèi)蛋白的泛素化是人類冠狀病毒編碼的一種新DUB酶。

簡介：高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法HIGHLYACTIVEANTIRETROVIRALTHERAPY，HAART被認(rèn)為是現(xiàn)今治療HIVAIDS行之有效的辦法。包括個體間藥代動力學(xué)差異在內(nèi)的諸多因素影響藥物在體內(nèi)發(fā)揮作用。為了提高藥物的治療效果，使得藥物在有效濃度水平發(fā)揮效能，并且減小毒性，國外已經(jīng)開展了治療藥物監(jiān)測THERAPEUTICDRUGMONITING，TDM以幫助個體化用藥劑量。針對國內(nèi)一線的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，目前尚無大樣本量的以中國人為研究對象的有效血藥濃度數(shù)據(jù)。研究目的探討奈韋拉平NVP、齊多夫定AZT和司他夫定D4T血藥濃度與療效、耐藥和不良反應(yīng)的相關(guān)性。對象與方法隨機(jī)選取HIVAIDS門診規(guī)律隨診，服用固定HARRT方案，自愿簽署知情同意書的患者共計244人男123人，女121人，在服藥前或服藥后2～4小時抽取EDTA抗凝靜脈血2ML，用高效液相色譜法方法檢測藥物血漿濃度。詳細(xì)記錄患者治療前及每次隨診的一般情況及實(shí)驗室檢查結(jié)果。結(jié)果1血漿NVP谷濃度在病毒學(xué)失敗組381ΜGML顯著低于病毒抑制組540ΜGML，P0018，在對NVP耐藥組323ΜGML顯著低于未發(fā)生耐藥組592ΜGML，P0004。2與國外通用的3ΜGML相比，39ΜGML是更適合中國人群的治療濃度下限。NVP血漿谷濃度低于39ΜGML時，發(fā)生病毒學(xué)失敗和耐藥的幾率是NVP血漿谷濃度高于39ΜGML時的54倍和63倍。3男性人群中，發(fā)生嚴(yán)重肝損的患者的NVP血漿谷濃度中位值820ΜGML顯著高于未發(fā)生嚴(yán)重肝損的患者548ΜGML，P0015。NVP血漿谷濃度超過8ΜGML時，發(fā)生嚴(yán)重肝損的幾率是NVP血漿谷濃度低于8ΜGML時的24倍。4皮疹的發(fā)生與NVP血漿峰谷濃度均無顯著相關(guān)性。5服用AZT后出現(xiàn)骨髓抑制的患者其AZT血漿峰濃度中位值068ΜGML顯著高于未發(fā)生骨髓抑制的患者025ΜGML，P0001。6D4T血藥濃度與血脂異常、周圍神經(jīng)病、脂肪異常分布無顯著相關(guān)性。結(jié)論1NVP早期病毒學(xué)應(yīng)答和病毒耐藥的發(fā)生與奈韋拉平血漿谷濃度有顯著的相關(guān)性。NVP血漿谷濃度低于治療濃度下限將增加病毒學(xué)失敗和耐藥的風(fēng)險。2NVP血漿谷濃度高于治療濃度上限將增加嚴(yán)重肝毒性的發(fā)生。3適合中國人的NVP谷濃度的治療濃度范圍是3980ΜGML。4AZT血漿峰濃度與骨髓抑制有顯著相關(guān)性。5D4T血漿峰濃度與其常見不良反應(yīng)的發(fā)生無顯著相關(guān)性。

簡介：背景和目的非結(jié)構(gòu)蛋白1NONSTRUCTURALPROTEIN1NS1是甲型流感病毒的一種重要調(diào)控蛋白，NS1最重要的作用就是在流感病毒感染機(jī)體時，其RNA結(jié)合區(qū)和效應(yīng)區(qū)能拮抗機(jī)體I型干擾素反應(yīng)包括抑制I型干擾素的產(chǎn)生以及拮抗依賴IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的抗病毒效應(yīng)，在幫助流感病毒逃避機(jī)體固有免疫中起到重要作用，其C末端的最后4個是NS1蛋白的PBM結(jié)合基序PDZBINDINGMOTIFPBM基序，與流感病毒的毒力有關(guān)。自從2013年3月底中國上海報道了世界上第一例甲型H7N9禽流感病毒能感染人致死病例后，有關(guān)甲型H7N9禽流感病毒的研究就引起了人類廣泛的關(guān)注。為了研究甲型H7N9禽流感病毒的毒力，我們針對甲型H7N9禽流感病毒的NS1蛋白開展了以下研究利用POLYIC模擬雙鏈RNA誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生，比較H7N9病毒在內(nèi)的幾株甲型流感病毒的NS1蛋白拮抗IFN系統(tǒng)反應(yīng)的能力。同時，我們利用本實(shí)驗室構(gòu)建的負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳通用載體P2K，以APUERTORICO834H1N1為骨架，構(gòu)建了含PR8流感病毒8個片段的重組質(zhì)粒和1個含H7N9流感病毒的NS片段質(zhì)粒，將含PR8病毒的7片段的重組質(zhì)粒和含H7N9的NS片段的質(zhì)粒（71）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，旨在利用反向遺傳技術(shù)拯救出PR8NS79重組流感病毒。另外，通過酵母雙雜交等技術(shù)檢測NS79蛋白、缺失了PBM結(jié)合基序（ESKV）的NS51突變蛋白和PSD95蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果1REALTIMEPCR結(jié)果證明，表達(dá)外源NS1蛋白的293T細(xì)胞，POLYIC刺激后，I型干擾素和促炎因子（IL1Β和TNFΑ）轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；IL6轉(zhuǎn)錄水平除PNFH5N1NS1組上調(diào)表達(dá)，其他組均下調(diào)，而CCL5轉(zhuǎn)錄因子除PNFPR8NS1組下調(diào)表達(dá)，其他組皆上調(diào)表達(dá)。2酶切鑒定及DNA測序分析表明成功克隆反向遺傳系統(tǒng)重組載體，但重組病毒血凝實(shí)驗未檢測出病毒效價。3缺失了NS1蛋白C末端PBM基序的突變蛋白NSDESKV能在二缺平板正常生長，不能在四缺平板上生長，證實(shí)了C末端PBM基序能影響NS1蛋白與PSD95蛋白的結(jié)合。另外，C末端天然缺失了包括PBM基序在內(nèi)的13個氨基酸的NS79（蛋白也不能和PSD95結(jié)合，可能與C末端PBM基序的缺失有關(guān)。結(jié)論1不同亞型的NS1蛋白拮抗I型干擾素和促炎因子（IL1Β和TNF?。┺D(zhuǎn)錄水平具有毒株差異，其中，PR8流感病毒拮抗作用表現(xiàn)最強(qiáng)，H7N9和ST602（H3N2）流感病毒NS1蛋白拮抗作用最弱，ST169H3N2）、H5N1和H9N2流感病毒的NS1蛋白拮抗I型干擾素和促炎因子（IL1Β和TNFΑ）轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢相似。2未檢測到轉(zhuǎn)染了8個重組質(zhì)粒的細(xì)胞上清接種的雞胚尿囊液病毒血凝效價，提示利用反向遺傳系統(tǒng)包裝成重組流感病毒PR8NS79的病毒滴度太低或沒有包裝出病毒樣顆粒，有待進(jìn)一步優(yōu)化病毒拯救條件。3禽流感病毒的NS1蛋白C末端PBM結(jié)合基序（ESKV）缺失后，失去與PSD95結(jié)合的能力；天然缺失了C末端PBM基序的NS79蛋白也不能和PSD95蛋白結(jié)合，提示C末端的PBM基序可能是影響NS1蛋白和PSD95蛋白結(jié)合的重要位點(diǎn)。

簡介：背景HEPB的長期、廣泛使用可能對人群HBV的流行強(qiáng)度和流行特征產(chǎn)生影響。為了解HEPB接種20年后山東省HBV血清流行病學(xué)和分子流行病學(xué)現(xiàn)狀及特征，于2006年9月開展本研究。研究目的了解HEPB使用20年后山東省社區(qū)人群HBV血清學(xué)指標(biāo)流行率、分布特征、感染模式構(gòu)成以及青少和成人HBV感染的主要危險因素；與新生兒普種HEPB初期比較，探討山東省乙肝流行病學(xué)特征的變化趨勢，對防治效果進(jìn)行初步評價。了解山東省社區(qū)人群中HBV基因型、血清學(xué)亞型、HBVS基因變異株和HBV隱匿性感染的流行狀況、分布特點(diǎn)以及病毒株的分子生物學(xué)特點(diǎn)，為完善乙肝控制策略提供參考。第一部分乙型病毒性肝炎血清流行病學(xué)研究材料與方法根據(jù)人群HEPB免疫策略調(diào)整情況，將研究對象分為新生兒普種HEPB前出生、新生兒HEPB自費(fèi)接種時期出生和HEPB計劃免疫時期出生3個年齡組，分別計算樣本量；通過多階段隨機(jī)抽樣在山東省12個縣隨機(jī)抽取1～59歲調(diào)查對象7601人。對所有調(diào)查對象進(jìn)行問卷調(diào)查和血標(biāo)本采集；使用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，檢測調(diào)查對象血清HBSAG、乙肝病毒表面抗體、乙肝病毒核心抗體，HBSAG陽性者進(jìn)一步檢測乙肝病毒E抗原和乙肝病毒E抗體。結(jié)果與分析1人群HEPB接種情況。山東省1～59歲人群HEPB全程接種率為2707％，1～4歲人群HEPB全程接種率顯著高于5～14歲和15～59歲人群；10～14歲人群HEPB全程接種率顯著低于10歲以下各年齡組。全省1～14歲人群首針HEPB時接種率為6541％；1歲組HEPB1及時接種率顯著高于8歲以上各年齡組，城市地區(qū)HEPB1及時接種率顯著高于農(nóng)村地區(qū)；在家出生者顯著低于在鄉(xiāng)鎮(zhèn)級和縣級以上醫(yī)院出生者。2HBV血清學(xué)指標(biāo)流行率和分布特征。全省1～59歲人群HBSAG流行率為339％，15～59歲人群HBSAG流行率顯著高于1～4歲和5～14歲人群；東、中、西部和城鄉(xiāng)之間，以及不同性別人群之間HBSAG流行率無顯著差異；與新生兒普及HEPB初期相比，1～59歲人群HBSAG流行率下降4703％，而1～4歲和5～14歲兒童分別下降8838％和8095％。全省1～59歲人群ANTIHBS流行率為4496％，15～59歲人群ANTIHBS流行率顯著低于1～4歲和5～14歲人群；不同地區(qū)和不同性別人群ANTIHBS流行率無顯著差別；與新生兒普及HEPB初期相比，1～59歲人群ANTIHBS流行率上升9982％，1～4歲和5～14歲兒童分別上升297和244倍。全省1～59歲人群HBV流行率為2426％，15～59歲人群HBV流行率顯著高于1～4歲和5～14歲人群；城市地區(qū)HBV流行率顯著高于農(nóng)村地區(qū)；與新生兒普及HEPB初期相比，全人群HBV流行率下降5148％，14歲和5～14歲兒童分別下降9495％和8883％。全省1～59歲人群中HBV易感率為4825％，其中15～59歲人群HBV易感率顯著高于1～4歲和5～14歲人群；農(nóng)村地區(qū)人群HBV易感率顯著高于城市地區(qū)。3不同HEPB免疫史人群HBV流行率。有HEPB免疫史人群ANTIHBS流行率顯著高于無免疫史和免疫史不詳人群，HBV流行率顯著低于無免疫史和免疫史不詳人群；未發(fā)現(xiàn)不同HEPB免疫史人群HBSAG流行率存在顯著差別。在嬰兒期完成3劑次HEPB的1～14歲人群中，10～14歲組人群HBV流行率顯著高于10歲以下人群。4HBV血清學(xué)指標(biāo)檢出模式。調(diào)查對象共檢出10種HBV血清學(xué)指標(biāo)組合模式，其中第8種感染模式檢出率最高，占調(diào)查對象的4369％；第10種感染模式次之，占調(diào)查對象的3768％；不同年齡、HEPB免疫史人群HBV血清學(xué)感染模式不同。育齡期婦女中共檢出9種感染模式，其中第10種模式所占比例最高，為5138％；其次為第7種和第8種模式，分別占2234％和1807％，以上3種模式合計占調(diào)查育齡期婦女的9179％；第4種和第6種占調(diào)查育齡期婦女的158％。5青少年及成人HBV感染危險因素分析。15～59歲人群HBV感染的主要危險因素按照值大小依次為長期一起生活的人HBSAG陽性、年齡＞30歲、有針灸史、男性和乙肝疫苗接種史為保護(hù)因素其值分別為200，157，131，120，078；其人群歸因危險百分比分別為201％、3027％、243％，770％和648％。結(jié)論山東省目前仍為乙肝中度流行區(qū)，青少年和成人中HBV流行強(qiáng)度顯著高于兒童，不同地區(qū)間流行差異依然存在。與新生兒普種HEPB初期相比，山東省HBV流行強(qiáng)度減弱，兒童時期流行高峰消失；人群特別是兒童HBV免疫水平明顯提高，山東省實(shí)施以“新生兒HEPB接種”為主的乙肝控制策略取得了顯著成效。目前山東省社區(qū)人群特別是成人中仍有大量HBV易感人群，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)乙肝控制工作。創(chuàng)新點(diǎn)首次對山東省HEPB使用20年后乙肝血清學(xué)流行狀況開展全省范圍大樣本研究。研究內(nèi)容系統(tǒng)全面，設(shè)計實(shí)施科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，分析方法具有創(chuàng)新，研究結(jié)論翔實(shí)可靠，為進(jìn)一步加強(qiáng)山東省乙肝控制工作提供了科學(xué)的依據(jù)。第二部分乙型病毒性肝炎分子流行病學(xué)研究材料與方法從本研究第一部分乙肝血清學(xué)研究保留的HBSAG陽性血清標(biāo)本中提取總核酸，采取巢氏聚合酶鏈反應(yīng)方法擴(kuò)增HBVS基因區(qū)，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序；用BIOEDITSEQUENCEALIGNMENTEDITSOFTWARE509軟件進(jìn)行核苷酸序列排列；用MEGA31軟件按照鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，在進(jìn)化樹上靠近的標(biāo)準(zhǔn)株基因型即為該標(biāo)本病毒株的基因型。使用MEGA31軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸聯(lián)排序列并進(jìn)行序列比較，根據(jù)S基因中122位、160位、127位、134位、159位、177位和178位氨基酸種類確定HBV血清學(xué)亞型，通過氨基酸序列比較確定S基因變異位點(diǎn)。計算不同地區(qū)和人群各HBV基因型和血清型的構(gòu)成比；分析HBVS基因變異株變異位點(diǎn)、變異形式和檢出率；利用X2檢驗或FISHERS精確概率法，對不同地區(qū)、不同年齡、性別、HEPB免疫史和血清學(xué)感染模式人群“A”抗原決定簇變異株檢出率的差異進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。按照系統(tǒng)抽樣方法，從HBV血清學(xué)研究保留的HBSAG陰性血清標(biāo)本中隨機(jī)抽取485份，提取總DNA，使用NESTEDPCR方法擴(kuò)增HBVS基因和C基因，兩次擴(kuò)增兩基因均為陽性者確定為OBI；利用以上相同方法確定OBI病毒株的基因型、血清型和S基因、C基因變異情況；計算不同地區(qū)、不同年齡、性別和血清學(xué)感染模式人群OBI檢出率，利用X2檢驗或FISHERS精確概率法對OBI檢出率差異進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。結(jié)果與分析1基因型和血清型分布。對102份HBSAG陽性血清標(biāo)本進(jìn)行了基因型、血清學(xué)亞型和HBVS基因變異的檢測。檢出B型和C型兩種基因型，其中9902％為C基因型且全部為C2亞型，僅1株為B基因型B2亞型；檢出ADRQ、ADW2和AYR3種血清型，其中ADRQ型占9608％，ADW2型占294％，AYR型占098％1102；3株ADW2血清型和1株AYR血清型毒株均來自山東省中部地區(qū)。2S基因變異株流行情況。102株HBV中共檢出15株“A”抗原決定簇變異株病毒，變異株檢出率為1470％；檢出11個“A”抗原決定簇AA位點(diǎn)的13種突變形式，其中9種突變形式既往有文獻(xiàn)報道，包括II26S、II26N、PL27T、Q129L、G130R、M133T、F134S、P142S和G145R；4種突變形式既往未見文獻(xiàn)報道，包括P135S、P135L、C137L和S143T；15株“A”抗原決定簇變異病毒株除4株發(fā)生I126S變異，各有2株發(fā)生P127T變異和G145R變異外，其余變異形式均僅在1株病毒中檢出；不同地區(qū)和不同年齡、性別、HEPB免疫史人群間“A”抗原決定簇變異株檢出率均無顯著性差異。102株病毒中，4314％被檢測出前S區(qū)變異，2157％發(fā)生在前S1區(qū)，1569％發(fā)生在前S2區(qū)，588％同時發(fā)生在前S1和前S2區(qū)；尤以前S1區(qū)的前端突變較為集中。3隱匿性乙肝病毒感染檢出率及分布情況。485份HBSAG陰性標(biāo)本中4份檢出OBI，檢出率為082％；不同HBV血清學(xué)指標(biāo)人群中OBI的檢出率有顯著差別。OBI毒株均為C基因型、ADRQ血清學(xué)亞型；2例出現(xiàn)“A”抗原決定簇變異，2例出現(xiàn)“A”抗原決定簇以外突變。結(jié)論山東省社區(qū)人群中HBV以C型基因、ADRQ血清型為主；少量的ADW2和AYR血清型主要集中在中部地區(qū)；社區(qū)人群中HBVS基因變異株的發(fā)生率較低，變異位點(diǎn)比較分散，野毒株仍是優(yōu)勢毒株；AAL26點(diǎn)是HBV“A”抗原決定簇最常見的變異位點(diǎn)。山東省社區(qū)人群中OBI檢出率較低；其檢出率與HBV血清學(xué)感染指標(biāo)有關(guān)。創(chuàng)新點(diǎn)本研究首次從無癥狀HBV攜帶者中證實(shí)C基因型和ADRQ血清型在山東省HBV流行的優(yōu)勢地位。在國內(nèi)首次從有代表性的社區(qū)人群中對S基因變異株特別是“A”抗原決定簇變異株的流行率、分布特征和分子生物學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了4種新的“A”抗原決定簇變異形式。本研究是國內(nèi)近20年來首次在社區(qū)人群中開展的OBI流行現(xiàn)狀研究。

簡介：我國于2012年戊型肝炎發(fā)病人數(shù)已超過甲型肝炎發(fā)病人數(shù)，成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此，加強(qiáng)戊型肝炎疫苗的研發(fā)并及時推廣應(yīng)用對預(yù)防和控制戊型肝炎意義重大。本研究用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)替代原先的大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，分泌性表達(dá)含N562糖基化位點(diǎn)的PF2的P179疫苗片段，并同時表達(dá)針對N562糖基化位點(diǎn)的P179突變體，進(jìn)而研究糖基化P179與點(diǎn)突變的P179在二聚體形成、抗原性、免疫原性以及誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生等方面的異同，以深入了解HEV結(jié)構(gòu)蛋白PF2的生物學(xué)特征，尋求更為安全有效的戊型肝炎重組疫苗。本研究主要分為3個部分一、HEVPF2N562潛在糖基化位點(diǎn)氨基酸基序的同源性分析為了解HEV結(jié)構(gòu)蛋白PF2N562潛在糖基化位點(diǎn)的保守性或變異程度，我們首先從GENBANK下載了共210個HEV1、2、3、4基因型及兔HEV、鼠HEV毒株的序列，利用生物信息學(xué)軟件LASERGENE70對210個包含HEV結(jié)構(gòu)蛋白PF2N562的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6株毒株GENBANKACCESSIONNUMBERSAB189070，AB425831，AB593690，AB698071，AB740232和JQ026407在N562位點(diǎn)糖基化基序由562NTT變成了562DTT，這6株毒株的共同之處是它們均為來源于日本的基因3型毒株。說明HEV結(jié)構(gòu)蛋白PF2N562潛在糖基化位點(diǎn)基序NXT在具有高度保守性的同時尚具有一定的變異性。隨著越來越多的新HEV毒株的出現(xiàn)，PF2N562潛在糖基化位點(diǎn)的氨基酸基序有可能發(fā)生其他更多的變異。二、P179及其N562突變體的畢赤酵母分泌性表達(dá)和特性分析我們首先在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上采用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)分泌性表達(dá)野生型P179，同時通過重組PCR技術(shù)將N562進(jìn)行4種定點(diǎn)突變，分別用酰胺類的谷氨酰胺Q、酸性氨基酸類的天冬氨酸D、亞氨基酸類的脯氨酸P和芳香族類的酪氨酸Y替代野生型的天冬酰胺N，改變潛在糖基化位點(diǎn)的氨基酸保守性基序，并在畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行分泌性表達(dá)。表達(dá)獲得的P179蛋白分別命名為P179N562、P179N562Q、P179N562D、P179N562P和P179N562Y，通過SDSPAGE結(jié)合衣霉素TUNICAMYCIN糖基化干預(yù)試驗分析野生型P179N562和其突變體的糖基化修飾以及糖基化修飾對P179空間結(jié)構(gòu)的影響。最后分別與抗HEV特異性單克隆抗體及戊型肝炎恢復(fù)期病人血清抗HEVIGG陽性進(jìn)行WESTERNBLOT反應(yīng)，評價糖基化和去糖基化對P179蛋白免疫反應(yīng)性的影響。結(jié)果如下A利用重組PCR技術(shù)成功將HEVPF2中的N562進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變?yōu)轷０奉惖墓劝滨０?、酸性氨基酸類的天冬氨酸、亞氨基酸類的脯氨酸、芳香族類的酪氨酸，?jīng)測序驗證。應(yīng)用PSIPRED方法分析預(yù)測P179N562及P179N562Q、P179N562D、P179N562P、P179N562Y蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果均以無規(guī)卷曲為主，其次為Β折疊，最后為Α螺旋。HEVP179N562和HEVF2P179N562Q、P179N562D、P179N562P二級結(jié)構(gòu)一致，其中無規(guī)卷曲占6145％、Β折疊占3520％、Α螺旋占335％。P179N562Y與其他四種蛋白的二級結(jié)果略有差異，其中無規(guī)卷曲占6034％、Β折疊占3631％、Α螺旋占335％，第559與560位氨基酸由原來的無規(guī)卷曲變?yōu)棣⒄郫B。B利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了分別含HEVP179野生型及其突變體的PPICZΑA重組質(zhì)粒，并在畢赤酵母菌株SMD1168中實(shí)現(xiàn)了分泌性表達(dá)。SDSPAGE顯示P179N562、P179N562Q和P179N562D呈二聚體，分子質(zhì)量分別為48KDA、42KDA和42KDA蛋白樣品加熱處理后均變?yōu)閱误w，分子質(zhì)量分別為24KDA、21KDA和21KDA。無論是二聚體還是單體，野生型P179N562的分子質(zhì)量均高于突變體，提示P179N562在酵母細(xì)胞真核表達(dá)時被糖基化修飾。另外2個突變體P179N562P和P179N562Y無論在天然狀態(tài)下還是經(jīng)加熱處理后均呈單體形式，分子質(zhì)量均為21KDA，不能形成二聚體。C在衣霉素糖基化干預(yù)試驗中，P179N562經(jīng)衣霉素處理干預(yù)后分子質(zhì)量由原來的48KDA降至42KDA，而P179N562Q、P179N562D、P179N562P和P179N562Y的衣霉素干預(yù)組與未干預(yù)組的分子質(zhì)量保持一致，分別還是42KDA、42KDA、21KDA和21KDA，二聚體和單體的特征未發(fā)生改變。進(jìn)一步證實(shí)P179N562在酵母細(xì)胞真核表達(dá)時被糖基化修飾，其分子質(zhì)量的增加是N562發(fā)生糖基化的結(jié)果。D在與HEV中和性單克隆抗體5G5進(jìn)行WESTERNBLOT反應(yīng)時，P179N562、P179N562Q、P179N562D以二聚體形式與5G5反應(yīng)，經(jīng)加熱變?yōu)閱误w后不與5G5反應(yīng)。P179N562和P179N562Q、P179N562D二聚體不與針對線性表位的單克隆抗體6F9反應(yīng)，但加熱變?yōu)閱误w后能與6F9反應(yīng)。P179N562P、P179N562Y均以單體形式與5G5、6F9反應(yīng)，但兩者經(jīng)加熱后不與5G5反應(yīng)，與6F9的反應(yīng)不受影響。表明P179中和抗原表位的結(jié)構(gòu)和功能與其是否形成二聚體無關(guān)，加熱使二聚體解聚的同時破壞了中和性抗原表位。此外，在雙抗體夾心法檢測酵母培養(yǎng)上清中的P179抗原時，P179N562、P179N562Q、P179N562D、P179N562P與P179N562Y具有良好的抗原性，但P179N562的檢測效果差于突變體，并且這種差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜005，這可能與P179N562增加的糖鏈遮蓋了部分抗原表位有關(guān)。三、P179及其N562突變體的免疫原性和免疫血清的HEV中和作用為進(jìn)一步比較糖基化P179N562與非糖基化的P179突變體的免疫原性，尤其是它們所誘導(dǎo)的免疫血清對HEV中和作用差異，我們將等量的P179N562、P179N562Q、P179N562D、P179N562P、P179N562Y分別免疫小鼠，定期采集小鼠血清，用ELISA檢測抗HEVIGG抗體，觀察抗體的變化直至免疫后40周。此外，我們采用基于PCR的HEV體外中和試驗，來評價P179N562、P179N562Q、P179N562D、P179N562P、P179N562Y免疫小鼠血清的中和活性。結(jié)果如下AP179N562、P179N562Q、P179N562D、P179N562P和P179N562Y免疫小鼠后，免疫血清在第3周可以檢測出抗HEVIGG抗體，大多在免疫后的第8周抗體滴度達(dá)到高峰，此后逐漸下降，但直至免疫后40周各組免疫血清中抗HEVIGG抗體仍持續(xù)陽性，說明P179N562、P179N562Q、P179N562D、P179N562P和P179N562Y具有良好的免疫原性。BHEV的細(xì)胞培養(yǎng)十分困難，尚無常規(guī)的體外中和試驗，也無敏感小動物模型。我們采用基于一步法RTPCR的體外中和試驗檢測P179N562、P179N562Q、P179N562D、P179N562P和P179N562Y小鼠免疫血清的中和作用，其中和效價分別為1∶20、1∶80、1∶20、1∶640和1∶160，以P179N562P免疫血清的中和作用最強(qiáng)，糖基化的P179N562誘導(dǎo)的中和抗體效價低。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明1HEV結(jié)構(gòu)蛋白PF2N562潛在糖基化位點(diǎn)的氨基酸基序NXT具有高度的保守性，但也具有一定的變異性，部分3型毒株由562NTT突變成562DTT，糖基化基序丟失。2HEV結(jié)構(gòu)蛋白PF2羧基端片段P179野生型P179N562及其4種N562定點(diǎn)突變體P179N562Q、P179N562D、P179N562P和P179N562Y均能在畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中分泌性表達(dá)，P179N562被糖基化修飾，而突變體不能被糖基化修飾。3分泌性表達(dá)的野生型P179N562及N562突變成谷氨酰胺的P179N562Q或天冬氨酸的P179N562D均天然形成二聚體，加熱變性則二聚體變成單體，但突變成脯氨酸的P179N562P或酪氨酸的P179N562Y只以單體形式存在。4所有二聚體P179和天然單體P179均能與中和性單克隆抗體5G5反應(yīng)，但加熱變性后形成的所有單體P179基本不再與5G5反應(yīng)，說明P179中和抗原表位的結(jié)構(gòu)和功能與其是否形成二聚體無關(guān)，加熱處理能夠同時破壞P179的二聚體結(jié)構(gòu)和中和抗原表位。5野生型糖基化的P179N562以及N562突變體非糖基化的P179N562Q、P179N562D、P179N562P和P179N562Y均具有良好的免疫原性和抗原性，均能誘導(dǎo)HEV中和抗體的產(chǎn)生，說明N562不參與P179中和抗原表位的形成，但N562糖基化的糖鏈有可能對中和抗原表位有部分遮蓋作用，它誘導(dǎo)的中和抗體效價低非糖基化的N562突變體P179N562P的天然單體誘導(dǎo)中和抗體的效價最高，有可能成為戊型肝炎重組疫苗的候選品，值得深入研究。

簡介：乙肝病毒HEPATITISBVIRUSHBV是目前已知的感染人類最小的雙鏈DNA病毒屬于嗜肝DNA病毒科HEPADNAVIVIDAE。乙肝病毒感染肝細(xì)胞后能引起一系列的疾病如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等還往往伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥然而在過去的三十年由于缺乏理想合適的經(jīng)濟(jì)型HBV感染模型對HBV的感染機(jī)制和發(fā)病機(jī)制特別是早期感染機(jī)制不清楚。乙肝病毒有嚴(yán)格的宿主特異性除了黑猩猩以外缺乏理想的易感動物模型。雖然黑猩猩能被乙肝病毒感染而且跟人有親源關(guān)系具有類似人的乙肝病毒感染史但是屬于瀕危動物來源困難、價格昂貴存在倫理等問題所以應(yīng)用受到限制不能作為常規(guī)實(shí)驗動物進(jìn)行研究。因此需要來源廣泛且經(jīng)濟(jì)適用的小型動物代替黑猩猩作為HBV感染模型。雖然目前已經(jīng)有一系列經(jīng)濟(jì)型的小鼠模型在使用如HBV轉(zhuǎn)基因小鼠、HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型、免疫缺陷嵌合肝小鼠模型但都存在各自的缺點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因小鼠模型存在遺傳不穩(wěn)定、對HBV免疫耐受、病毒復(fù)制過程缺少CCCDNA不適合用于HBV體內(nèi)復(fù)制機(jī)制和病毒清除機(jī)制的研究。HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型因為分泌的HBV病毒不能感染健康的小鼠肝細(xì)胞不適合作為HBV感染機(jī)制、發(fā)病機(jī)制的模型進(jìn)行研究作為抗病毒藥物藥效的評價模型也不是很理想因為病毒很快就被清除。嵌合肝免疫缺陷小鼠模型嵌合了人肝細(xì)胞因此可以作為研究HBV感染機(jī)制、抗病毒藥物藥效學(xué)評價的模型但是人肝細(xì)胞來源困難雖然可以用樹鼩肝細(xì)胞代替但是這樣還不如直接使用樹鼩模型。早在90年代瑞士和德國科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)樹鼩對HBV具有易感性他們進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗獲得證實(shí)。他們在樹鼩原代肝細(xì)胞體外感染HBV實(shí)驗中肝細(xì)胞內(nèi)能檢測到HBVDNA、HBVRNA且細(xì)胞上清中有HBSAG和HBEAG的分泌表明樹鼩肝細(xì)胞能被HBV感染而且病毒能在樹鼩肝細(xì)胞進(jìn)行繁殖樹鼩肝細(xì)胞對HBV的易感性后來也被大量的實(shí)驗證明。樹鼩在體內(nèi)感染HBV實(shí)驗中他們發(fā)現(xiàn)樹鼩肝組織中有HBVDNA的表達(dá)并且血液中出現(xiàn)了HBSAG接著產(chǎn)生了HBSAB、HBEAB、HBCAB病毒很快就被清除表明樹鼩體內(nèi)能感染HBV并且屬于一種急性自限性感染。既然證實(shí)樹鼩體內(nèi)外均能被HBV有效感染具有完整的病毒感染和復(fù)制過程而且感染后能引起機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)答并被被機(jī)體清除甚至可能引起肝組織病理變化這些表明樹鼩不僅可用于研究HBV感染機(jī)制和機(jī)體免疫清除病毒機(jī)制而且可作為抗HBV新藥藥效學(xué)評價的模型大量的體外研究證實(shí)了樹鼩肝細(xì)胞的這種應(yīng)用價值。但是一直以來沒有科學(xué)家在樹鼩體內(nèi)進(jìn)行抗HBV藥物藥效學(xué)的評價研究工作一方面是由于樹鼩沒有穩(wěn)定的品系不像其它動物品系那樣具有很好的重復(fù)性另一方面沒有人進(jìn)行樹鼩感染HBV后詳細(xì)的病程研究對樹鼩感染HBV后體內(nèi)病毒繁殖情況以及是否引起樹鼩病理變化不清楚。不過這給我們一個提示如果對樹鼩感染HBV后的詳細(xì)病程進(jìn)行深入研究以樹鼩在體模型作為抗乙肝病毒新藥藥效學(xué)評價模型將更有說服力?；诖宋覀冏隽舜罅康臉潼氃隗w感染HBV實(shí)驗研究感染后的病理過程。首先摸索樹鼩的有效HBV感染劑量再確定采血時間點(diǎn)通過對血液化驗分析、肝組織免疫組化和病理分析深入研究樹鼩感染HBV后詳細(xì)的病理過程并建立病程圖。本次實(shí)驗不僅有助于深入研究樹鼩感染HBV后的發(fā)病機(jī)制而且能給新藥藥效學(xué)的評價體系提供參考數(shù)據(jù)具有重要的醫(yī)學(xué)研究意義。目前臨床對乙肝的治療策略僅限于對HBV在病人體內(nèi)的復(fù)制進(jìn)行干預(yù)主要通過干擾素和核苷類藥物應(yīng)用。雖然這些藥能暫時能有效控制住病毒的復(fù)制但是不能完全清除病毒一旦停藥仍會復(fù)發(fā)。而且干擾素存在著副作用、穩(wěn)定性差、半衰期短等特點(diǎn)核苷類藥物則容易引起乙肝病毒突變株和耐藥株雖然通過聯(lián)合用藥可以提高療效且降低乙肝病毒突變株和耐藥株的產(chǎn)生幾率但是這種抑制病毒復(fù)制的治療方案不能從根本上治愈乙肝。近年來通過HEPRG細(xì)胞系和樹鼩原代肝細(xì)胞模型的研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒表面抗原PRES1蛋白可能與HBV結(jié)合宿主肝細(xì)胞有關(guān)肝細(xì)胞的HBV受體的結(jié)合位點(diǎn)可能就位于PRES1上而且大量體外的研究證實(shí)了PRES1N端的48AA可能就是HBV結(jié)合肝細(xì)胞步驟中的關(guān)鍵位點(diǎn)而且來源于PRES1N端的48AA的衍生肽經(jīng)豆蔻酰修飾后具有很強(qiáng)的阻斷病毒感染肝細(xì)胞的效果IC50約為8NM。但是目前這種衍生肽的藥效學(xué)評價僅限于體外研究沒有在動物體內(nèi)進(jìn)一步評價。這提示我們?nèi)绻趧游锶鐦潼汅w內(nèi)進(jìn)一步評價這種衍生肽的藥效更能體現(xiàn)出阻斷乙肝病毒感染的藥效。綜上所述我們決定建立樹鼩體內(nèi)外感染乙肝病毒模型并應(yīng)用于乙肝病毒表面抗原PRES1衍生肽L47的藥效評價。我們首先在體外實(shí)驗中證實(shí)L47阻斷HBV感染藥效然后在樹鼩體內(nèi)進(jìn)一步進(jìn)行抗乙肝病毒藥效學(xué)評價。第一部分實(shí)驗我們建立樹鼩體內(nèi)外感染乙肝病毒模型并進(jìn)行鑒定。首先建立樹鼩肝細(xì)胞體外感染乙肝病毒模型通過不連續(xù)蔗糖梯度離心獲得的乙肝病病毒用于體外感染實(shí)驗兩步灌注法分離樹鼩肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)作為病毒感染對象用不同感染復(fù)數(shù)的乙肝病毒進(jìn)行孵育感染發(fā)現(xiàn)乙肝病毒能有效感染樹鼩肝細(xì)胞并在肝細(xì)胞內(nèi)的繁殖病毒表達(dá)量與感染復(fù)數(shù)成良好的依賴關(guān)系表明我們成功建立了HBV體外感染模型然后我們建立樹鼩體內(nèi)感染乙肝病毒模型通過摸索有效HBV感染劑量和采血時間點(diǎn)并對采集到的血液標(biāo)本進(jìn)行病毒血清學(xué)定量檢測、ALT生化定量測定、HBVDNA熒光定量PCR檢測我們不但證實(shí)了HBV感染樹鼩后能在肝組織內(nèi)大量繁殖而且發(fā)現(xiàn)HBV引起樹鼩急性肝炎。第二部分實(shí)驗在建立好的體外感染模型上證實(shí)L47具有阻斷HBV感染樹鼩肝細(xì)胞的藥效發(fā)現(xiàn)L47半抑制率IC50約為25NMN7低于報道的類似衍生肽8NM的半抑制率表明能更有效阻斷病毒感染具有更好的開發(fā)和應(yīng)用前景在樹鼩體內(nèi)感染乙肝病毒模型上進(jìn)一步評價L47阻斷HBV感染的藥效作用發(fā)現(xiàn)008MGKG的L47劑量能非常顯著的降低樹鼩體內(nèi)的病毒復(fù)制和預(yù)防病毒感染引起的肝功異常。

簡介：點(diǎn)擊查看更多江門兒童、成人腹瀉中諾如病毒感染的分子流行病學(xué)研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：廈門大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表的研究成果，均在文中以適當(dāng)方式明確標(biāo)明，并符合法律規(guī)范和廈門大學(xué)研究生學(xué)術(shù)活動規(guī)范試行。另外，該學(xué)位論文為捧夭辛課題組的研究成果，獲得林太印課題組經(jīng)費(fèi)或?qū)嶒炇业馁Y助，在替黍印實(shí)驗室完成。請在以上括號內(nèi)填寫課題或課題組負(fù)責(zé)人或?qū)嶒炇颐Q，未有此項聲明內(nèi)容的，可以不作特別聲明。＼聲明人簽名潺19日歌聲明人簽名蝓勺勺很加1Z年6月Y日廈門大學(xué)學(xué)位論文著作權(quán)使用聲明本人同意廈門大學(xué)根據(jù)中華人民共和國學(xué)位條例暫行實(shí)施辦法等規(guī)定保留和使用此學(xué)位論文，并向主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文包括紙質(zhì)版和電子版，允許學(xué)位論文進(jìn)入廈門大學(xué)圖書館及其數(shù)據(jù)庫被查閱、借閱。本人同意廈門大學(xué)將學(xué)位論文加入全國博士、碩士學(xué)位論文共建單位數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版，采用影印、縮印或者其它方式合理復(fù)制學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于|IX1經(jīng)廈FJK學(xué)保密委員會審查核定的保密學(xué)位論文，于2014年9月1日解密，解密后適用上述授權(quán)。，、／2不保密，適用上述授權(quán)。聲明人簽名加7Z年6月溽習(xí)4承

簡介：目的了解黑龍江省肇東市自然人群中乙型肝炎病毒HBV基因型、血清亞型分布情況及基因型與血清亞型的關(guān)系；了解自然人群中HBVS基因的核苷酸水平變異及氨基酸水平變異情況；分析HBV基因型與臨床轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系。方法2005年，以黑龍江省肇東市雙勝村和先鋒村兩個農(nóng)村為研究現(xiàn)場，以全屯居民為研究對象，對全屯居民進(jìn)行了一次橫斷面血清流行病學(xué)調(diào)查，采用固相放射免疫SPRIA法檢測HBSAG、抗HBS和抗HBC三項乙肝病毒感染指標(biāo)，采用酶聯(lián)免疫ELISA法檢測HBEAG和抗HBE兩項感染指標(biāo)。結(jié)合1986年這兩個現(xiàn)場的血清流行病學(xué)調(diào)查資料，綜合ALT、B超和臨床體檢等結(jié)果，按照2005年12月10日制定的慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇可作出明確臨床診斷的110例作為研究對象。其中無癥狀HBV攜帶者86例，慢性乙型肝炎CH12例，肝硬化LC5例，肝細(xì)胞肝癌HCC1例，恢復(fù)6例。男性60例，女性50例。平均年齡36歲。對從110例研究對象中抽取的血清標(biāo)本采用巢式PCR法擴(kuò)增HBVDNA。利用QIAAMPDNABLOODMINIKIT，按照試劑盒操作說明書要求從200ΜL血清中提取HBVDNA，將其作為模板，設(shè)計合成2對引物擴(kuò)增HBVS基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，應(yīng)用WIZARDSVGELPCRCLEANUPSYSTEM試劑盒進(jìn)行純化回收。將回收后的產(chǎn)物送生物公司利用ABI3773自動熒光測序儀測序。利用DNASTAR軟件對測序標(biāo)本的核苷酸序列與從GENBANK中獲取的HBVAH各基因型標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對分析，繪制基因進(jìn)化樹，確定基因型。由核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列，確定血清亞型。應(yīng)用SAS81軟件對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行FISHER確切概率法的統(tǒng)計學(xué)處理分析，以P75例占862％，ADRQ2例占23％，ADW22例占23％；AVR8例占92％；1例D基因型標(biāo)本的血清亞型為AVW2亞型。用FISHER確切概率法對不同基因型的血清亞型構(gòu)成進(jìn)行統(tǒng)計分析，P值為00000，有統(tǒng)計學(xué)意義。9例B基因型感染者中，4例444％為，5例為CH556％；87例C基因型感染者中，3例為恢復(fù)者34％，73例為839％，7例為CH81％，3例為LC34％和1例為HCC12％；1例D基因型感染者為100％。FISHER確切概率法對不同基因型的臨床轉(zhuǎn)歸進(jìn)行統(tǒng)計分析，P值為00288，有統(tǒng)計學(xué)意義。本次試驗共獲得84例HBVS基因540NT完整序列結(jié)果。通過對這些核苷酸序列的堿基替換位點(diǎn)以及由核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列的突變位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)131個位點(diǎn)有堿基替換現(xiàn)象，其中40個位點(diǎn)為同義突變，89個位點(diǎn)為錯義突變，2個位點(diǎn)為無義突變。主要結(jié)構(gòu)同源區(qū)MHR，AA100160發(fā)現(xiàn)45個位點(diǎn)有堿基替換現(xiàn)象，其中18個位點(diǎn)為同義突變，27個位點(diǎn)為錯義突變。錯義突變中有2個位點(diǎn)產(chǎn)生了有意義的氨基酸突變Q129H1例和M133L1例，位于抗原決定簇A的第一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)。1例在AA119～120間有三個氨基酸TTE的插入。HBVS基因每100個核苷酸替換的頻數(shù)為219。結(jié)論1黑龍江肇東市HBV基因型分布以C基因型為主，存在少量的B型和D型。2黑龍江肇東市HBV血清亞型分布以ADR亞型為主ADRQ和ADRQ均有，但以ADRQ為主，存在少量的ADW2、AYR和AYW2亞型。3HBV不同基因型的血清亞型的構(gòu)成不同。B基因型標(biāo)本的血清亞型均為ADW2；C型標(biāo)本的血清亞型主要為ADR，有少量的ADW2和AYR；D型標(biāo)本的血清亞型為AVW2。提示HBV基因型與血清亞型存在一定的相關(guān)性。4HBV不同基因型的臨床轉(zhuǎn)歸不同。B基因型感染者中和CH均有，CH與者相比稍多。C基因型感染者中以為主，CH次之，其次為恢復(fù)、LC和HCC。提示B基因型感染者較易形成CH，C基因型感染者各種臨床轉(zhuǎn)歸均有，絕大多數(shù)為。5HBVS基因在許多位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)堿基替換現(xiàn)象，但近13堿基替換為同義突變。自然人群中存在一定的HBVS基因突變，未發(fā)現(xiàn)疫苗相關(guān)突變。核苷酸替換的平均頻數(shù)較低，提示S基因相當(dāng)保守。

簡介：點(diǎn)擊查看更多人巨細(xì)胞病毒流行病學(xué)調(diào)查及其核酸疫苗研究.pdf精彩內(nèi)容。