簡(jiǎn)介：目的嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒SEVEREFEVERWITHTHROMBOCYTOPENIASYNDROMEVIRUS，SFTSV，又名蜱蟲(chóng)病病毒，是近年在我國(guó)河南，安徽和湖北等中東部省份傳播的新發(fā)血液傳播病毒，由病毒感染引起的嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征具有1030％的致死率。目前，我國(guó)尚無(wú)SFTSV在獻(xiàn)血人群中的流行情況報(bào)道。本研究擬調(diào)查我國(guó)三個(gè)地區(qū)獻(xiàn)血人群嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的抗體和病毒血癥流行情況。方法本研究于2012年4月至10月，收集來(lái)自我國(guó)SFTSV主要流行疫區(qū)河南信陽(yáng)，非疫區(qū)洛陽(yáng)和四川綿陽(yáng)等三地共計(jì)17208份健康獻(xiàn)血員血漿樣本。采用酶聯(lián)免疫熒光法ENZYMELINKEDIMMUNOASSAY，ELISA對(duì)樣本進(jìn)行抗SFTSV總抗體檢測(cè)。同時(shí)，采用高靈敏度逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCRREVERSETRANASEPCR，RTPCR，對(duì)信陽(yáng)地區(qū)2490份匯集樣本（4人份一匯集，共9960人份）進(jìn)行SFTSV核酸匯集篩查，對(duì)核酸陽(yáng)性匯集進(jìn)行拆分核酸單檢，并對(duì)ELISA陽(yáng)性樣本也進(jìn)行核酸單檢確認(rèn)。結(jié)果我國(guó)三地獻(xiàn)血人群抗SFTSV總抗體流行情況依次為信陽(yáng)地區(qū)（主要流行疫區(qū)），054％8014752綿陽(yáng)地區(qū)，027％31130和洛陽(yáng)地區(qū)，023％31326。信陽(yáng)地區(qū)的抗SFTSV總抗體流行率略高于洛陽(yáng)和綿陽(yáng)地區(qū)，但無(wú)顯著性差異。信陽(yáng)地區(qū)80例抗體陽(yáng)性獻(xiàn)血員的年齡、性別和職業(yè)分布等人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征無(wú)顯著性差異。信陽(yáng)地區(qū)SFTSVRTPCR檢測(cè)結(jié)果表明，63個(gè)匯集為陽(yáng)性擴(kuò)增632490。進(jìn)一步拆分單檢后，檢出兩例SFTSV核酸陽(yáng)性樣本，且病毒載量均低于20PFUML，表明信陽(yáng)地區(qū)SFTSV核酸流行率為002％29960。結(jié)論SFTSV在我國(guó)信陽(yáng)、洛陽(yáng)和綿陽(yáng)三地區(qū)健康獻(xiàn)血人群中存在較低流行率，且病毒載量極低。SFTSV是否威脅我國(guó)血液安全還需進(jìn)一步的調(diào)查研究。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多嚴(yán)重急性呼吸道綜合征（SARS）S蛋白重組腺病毒疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)研究.pdf精彩內(nèi)容。

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簡(jiǎn)介：目的了解某地區(qū)獻(xiàn)血員及HBSAG陰性的白血病患者中隱匿性HBV感染的檢出率并探討其與研究對(duì)象年齡、性別、生化學(xué)檢測(cè)結(jié)果以及乙型肝炎病毒標(biāo)志物之間的關(guān)系同時(shí)從S基因變異角度探討隱匿性HBV感染可能的分子機(jī)制。方法①病例選擇和標(biāo)本收集收集2010年6月2010年9月間經(jīng)某地區(qū)血站篩查HBSAG陰性的合格獻(xiàn)血員血漿594份。另收集2010年9月2010年10月間某地區(qū)三甲醫(yī)院檢驗(yàn)科檢驗(yàn)結(jié)果為HBSAG、抗HBC定量檢測(cè)雙陽(yáng)性且HBVDNA陽(yáng)性的HBV感染者做對(duì)照。87份HBSAG陰性的白血病患者血清標(biāo)本均來(lái)自2010年8月至2010年12月間在某地區(qū)三甲醫(yī)院血液科確診為白血病的患者包括急性及慢性白血病患者。②HBVDNA提取采用經(jīng)典蛋白酶K消化酚氯仿法。③巢式PCR法檢測(cè)HBVDNA參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及HBV參照序列在HBV基因組S、C、X區(qū)分別設(shè)計(jì)一對(duì)巢式引物。巢式PCR擴(kuò)增當(dāng)任兩個(gè)區(qū)同時(shí)陽(yáng)性者定義為隱匿性HBV感染者。④雅培ARCHITECTI2000R電化學(xué)發(fā)光儀定量檢測(cè)隱匿性HBV感染者的HBV血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)隱匿性HBV感染者與非感染者進(jìn)行性別、年齡、生化學(xué)檢測(cè)結(jié)果以及HBV血清標(biāo)志物等的比較。⑤擴(kuò)增HBVDNA陽(yáng)性者小S區(qū)測(cè)序根據(jù)HBV參照序列在S區(qū)設(shè)計(jì)引物對(duì)隱匿性HBV感染者以及11例HBSAG和抗HBC雙陽(yáng)性的HBV感染者進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序并進(jìn)行基因型、HBSAG“Α”決定簇突變分析發(fā)現(xiàn)可能和隱匿性HBV感染有關(guān)的變異位點(diǎn)。結(jié)果一、獻(xiàn)血員①在594例獻(xiàn)血員中有15例為隱匿性HBV感染隱匿性HBV感染的發(fā)生率為25％15594。未發(fā)現(xiàn)HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果與隱匿性HBV感染有相關(guān)性。②將獻(xiàn)血員中隱匿性HBV感染者和陽(yáng)性對(duì)照ⅠS區(qū)的測(cè)序序列與HBV標(biāo)準(zhǔn)序列相比較結(jié)果共檢測(cè)到2種基因型HBVBHBVC其中HBVB基因型占優(yōu)勢(shì)10例隱匿性HBV感染者HBV基因型分別為HBVB9例HBVC1例而11例陽(yáng)性對(duì)照ⅠHBV基因型分別為HBVB10例HBVC1例。隱匿性HBV感染者和陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ相比較兩者的基因型分布并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③獻(xiàn)血員中15例隱匿性HBV感染者中共10人有S區(qū)測(cè)序結(jié)果其HBVDNA均有不同程度的變異其中共有3例在“A”決定簇內(nèi)出現(xiàn)氨基酸突變分別為I126T1例、T140I2例。與隱匿性HBV感染者相比陽(yáng)性對(duì)照Ⅰ在“A”決定簇內(nèi)僅出現(xiàn)了1例T131N變異。二、白血?、僭?7例HBSAG陰性的白血病中隱匿性感染者有15例隱匿性HBV感染的檢出率為1721587。實(shí)驗(yàn)組的年齡、性別分布、生化學(xué)檢測(cè)結(jié)果等與對(duì)照組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②在白血病患者中隱匿性HBV感染的抗HBC陽(yáng)性的檢出率46Q5顯著高于對(duì)照組中抗HBC陽(yáng)性檢出率97W2Χ212548P﹤0001即在白血病患者中抗HBC陽(yáng)性與否與隱匿性感染有顯著相關(guān)性。③白血病患者中隱匿性HBV感染者共檢測(cè)到2種基因型HBVBHBVC其中HBVC基因型占優(yōu)勢(shì)11例隱匿性HBV感染者HBV基因型分別為HBVC10例HBVB1例與獻(xiàn)血員中隱匿性HBV感染者的測(cè)序結(jié)果差別較大。④白血病中15例隱匿性HBV感染者中共11人有S區(qū)測(cè)序結(jié)果其中1例隱匿性HBV感染者出現(xiàn)了插入突變另2例提前形成終止密碼形成縮短的氨基酸序列并有6例有氨基酸突變存在。在不同基因型的隱匿性HBV感染者中在MHR區(qū)存在變異的5例基因型C病毒株均發(fā)生了I126T變異而唯一1例基因型B病毒株發(fā)生的是Q129R、D144E、S155Y聯(lián)合變異。結(jié)論①在本地區(qū)獻(xiàn)血員及HBSAG陰性的白血病患者中隱匿性HBV感染的檢出率分別為25和172。②在白血病患者中抗HBC陽(yáng)性與隱匿性HBV感染有明顯的相關(guān)性。③白血病患者中隱匿性HBV感染者與本地區(qū)慢性HBV感染者基因型有顯著不同。④HBVS區(qū)基因變異尤其是HBSAG“Α”決定簇存在氨基酸改變可能是隱匿性HBV感染的分子基礎(chǔ)但其意義尚有待明確。

簡(jiǎn)介：目的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及RTPCR法對(duì)武漢地區(qū)類(lèi)流感樣監(jiān)測(cè)病例的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行人鼻病毒HUMANRHINOVIRUSHRV和人腸道病毒HUMANENTEROVIRUSHEV的檢測(cè)和分型了解人鼻病毒人腸道病毒HRVHEV在武漢地區(qū)的感染現(xiàn)狀、亞型構(gòu)成、分子進(jìn)化以及年齡、季節(jié)分布等流行情況揭示和闡明人鼻病毒、人腸道病毒的流行特點(diǎn)及規(guī)律為人鼻病毒、人腸道病毒等相關(guān)呼吸道感染的防控、臨床診斷與治療、疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。研究對(duì)象及方法1收集武漢地區(qū)2007年7月至2011年12月期間武漢市一醫(yī)院和武漢市兒童醫(yī)院門(mén)診流感樣病例體溫≥38℃同時(shí)伴有咳速或咽痛之一者的咽拭子標(biāo)本共計(jì)4065份。2收集咽拭子標(biāo)本后低溫運(yùn)送至武漢市疾病預(yù)防控制中心病毒科。咽拭子標(biāo)本經(jīng)核酸提取后采用HRV、HEV通用引物及探針和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HRVHEV同時(shí)每份標(biāo)本采用PCR及RTPCR法檢測(cè)A型和B型副流感病毒IFVA和B型、人偏肺病毒HMPV、呼吸道合胞病毒RSV、偏肺病毒PIV1、2、3、冠狀病毒HCOVHKU1和NL63型、腺病毒ADV及人博卡病毒HBOV。隨機(jī)選取50例HRVHEV檢測(cè)陽(yáng)性樣本應(yīng)用HRV、HEV分型引物對(duì)VP4VP2區(qū)段進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序所得測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心NCBIGENEBANK中的序列進(jìn)行BLAST比較分析。利用MEGA51軟件中的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果在4065份流感樣病例的咽拭子標(biāo)本中共檢出HRVHEV陽(yáng)性標(biāo)本170例總檢出率為418％其中23例陽(yáng)性標(biāo)本存在與其它呼吸道病毒的混合感染23170135。在混合感染病例中333824的病例混合感染腺病毒ADV208524的病例混合感染冠狀病毒HCOV167424的病例混合感染副流感病毒PIV83224的病例混合感染人偏肺病毒HMPV83224的病例混合感染博卡病毒HBOV42124的病例混合感染甲型H1N1流感病毒42124的病例混合感染乙型流感病毒。各年齡組HRVHEV感染者中03歲、414歲、1525歲、2665歲及65歲年齡組的檢出率分別為701171662、4543948、055930、115477和000483歲以下包括3歲兒童陽(yáng)性率明顯高于3歲以上年齡組Χ257300P0000。2008年7月2011年12月檢測(cè)結(jié)果顯示HRVHEV在武漢地區(qū)流行呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性以春夏兩季為高發(fā)季節(jié)。50例HRVHEV通用引物檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本中34例分型成功。其中9例為HRV單獨(dú)感染23例為HEV單獨(dú)感染2例為HRV和HEV混合感染。11例HRV感染者中6例為HRVA5452例為HRVB1823例為HRVC27325例HEV感染者中10例為HEVA4015例為HEVB60。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)武漢地區(qū)流行的HRV、HEV與其對(duì)應(yīng)的參考株在進(jìn)化上十分接近但武漢流行株也表現(xiàn)出了基因變異和遺傳分化的跡象。結(jié)論HRVHEV的檢出率較高是引起武漢地區(qū)人群急性呼吸道感染的一個(gè)重要病因。不同年齡組HRVHEV感染率不同其中3歲及3歲以下兒童為易感人群。武漢地區(qū)HRVHEV的流行呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性以春夏兩季為高發(fā)季節(jié)。武漢地區(qū)HRV感染與HEV感染均呈現(xiàn)基因多樣性其中HRVA、HEVB分別為HRV感染和HEV感染最主要的基因型。

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子HUMANVULARENDOTHELIALGROWTHFACT，HVEGF165腺相關(guān)病毒ADENOASSOCIATEDVIRUS，AAV載體AAVHVEGF165，并體外檢測(cè)其在椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞中的表達(dá)，以及觀察AAVHVEGF165與AAVTGFΒ1TRANSFMINGGROWTHFACTBETA1，TGFΒ1基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ型膠原的生物學(xué)效應(yīng)。探討應(yīng)用HVEGF165基因逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)退變可行性。方法采用分子克隆技術(shù)，從PCDNA3HVEGF165質(zhì)粒獲得HVEGF165CDNA，并克隆至AAV包裝質(zhì)粒PSNAV上，構(gòu)建成PSNAVHVEGF165的AAV重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確，用脂質(zhì)體介導(dǎo)PSNAVHVEGF165轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞VEC，熒光免疫組化方法檢測(cè)HVEGF165蛋白，并用MTT法測(cè)定HVEGF165對(duì)VEC增殖的影響。由本元正陽(yáng)公司對(duì)鑒定正確的PSNAVHVEGF165進(jìn)行AAVHVEGF165的包裝。AAVHVEGF165與AAVTGFΒ1聯(lián)合轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞，WESTERNBLOTTING檢測(cè)HVEGF165與TGFΒ1的表達(dá)以及纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)量的變化。結(jié)論構(gòu)建的腺相關(guān)病毒載體AAVHVEGF165可在體外表達(dá)，HVEGF165在體外能夠協(xié)同TGFΒ1促進(jìn)纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)的增加，HVEGF165有可能基因逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)的早期退變。

簡(jiǎn)介：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV感染引起的一種常見(jiàn)的、嚴(yán)重的肝臟疾病。盡管一些抗病毒藥物如拉米夫定LAMIVUDINE，3TC、阿德福韋酯ADEFOVIRADV等能夠有效的抑制乙肝病毒復(fù)制，慢性乙肝仍然是一種無(wú)法徹底治愈的疾病。目前，在抗乙肝病毒治療中核苷類(lèi)藥物起著關(guān)鍵作用。但是，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥和毒副作用，這可能導(dǎo)致治療失敗、肝臟疾病的發(fā)展。因此，尋找療效顯著、低毒副作用的新型抗HBV藥物仍然具有重要意義。鴨乙型肝炎DUCKHEPATITISBVIRUS，DHBV模型是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的一種評(píng)價(jià)抗HBV藥物的體內(nèi)動(dòng)物模型。本文首先建立了河南地區(qū)后天感染麻鴨乙肝病毒模型，然后采用HEPG2215細(xì)胞為體外模型，評(píng)價(jià)新型核苷類(lèi)藥物ΑDDBDU的體外抗病毒活性采用建立的鴨乙肝模型為體內(nèi)模型，評(píng)價(jià)ΑDDBDU的體內(nèi)抗病毒活性及保肝作用。第一部分后天感染河南麻鴨乙肝病毒模型的建立。目的建立河南麻鴨乙型肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)模型，并初步觀察拉米夫定3TC體內(nèi)抗DHBV作用。方法篩選3日齡DHBV陰性河南麻鴨，經(jīng)脛靜脈注射DHBV陽(yáng)性血清，連續(xù)觀察42天，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)FLUSESCENCEQUANTITATIVEPOLYMERASECHAINREACTION，F(xiàn)QPCR檢測(cè)鴨血清和肝臟中DHBVDNA變化情況。隨后用3TC對(duì)建立的模型進(jìn)行初步應(yīng)用。模型組給予生理鹽水2MLKGD，3TC組給予3TC20MGKGD，連續(xù)給藥10天。FQPCR檢測(cè)給藥后5天、10天及停藥后3天血清和肝臟中DHBVDNA抑制率，并進(jìn)行肝臟病理學(xué)觀察。結(jié)果感染2D后，血清和肝臟中均可檢測(cè)到DHBVDNA。血清第14天達(dá)到高峰，肝臟第21天達(dá)到高峰，在42天內(nèi)均維持較高的DHBVDNA水平。3TC用藥10天后，血清和肝臟HBVDNA抑制率分別為8647％和8492％，肝組織炎性病變較模型組明顯減輕，但停藥3天有輕度“反跳”現(xiàn)象。結(jié)論河南麻鴨后天感染DHBV較敏感，病毒在體內(nèi)增殖穩(wěn)定，是DHBV感染的理想疾病模型，該模型可用于抗HBV藥物的篩選和評(píng)價(jià)。第二部分新型核苷聯(lián)苯雙酯化合物ΑDDBDU抗HBV作用研究。目的探討新型核苷類(lèi)化合物ΑDDBDU體內(nèi)和體外抗乙肝病毒作用。方法ΑDDBDU體外抗病毒活性的研究選用能夠合成、分泌HBV顆粒和表達(dá)HBV抗原標(biāo)志物的HEPG2215細(xì)胞株為模型，采用MTT法檢測(cè)不同濃度ΑDDBDU的細(xì)胞毒性酶聯(lián)免疫吸附法ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAY，ELISA檢測(cè)不同濃度ΑDDBDU對(duì)細(xì)胞上清中HBSAG和HBEAG的抑制作用FQPCR法檢測(cè)ΑDDBDU對(duì)細(xì)胞內(nèi)外HBVDNA水平的抑制作用。體內(nèi)抗病毒活性的研究采用已建立的后天感染河南麻鴨乙肝病毒模型。感染后，DHBV陽(yáng)性鴨隨機(jī)分成5組，藥物組給予不同劑量的ΑDDBDU（08、4和20MGKGD），陽(yáng)性對(duì)照組給與3TC20MGKGD，模型組與陰性對(duì)照組給予生理鹽水2MLKGD，連續(xù)給藥10天。在第5、10和停藥后第3天，收集血清和肝組織樣品，檢測(cè)血清和肝臟中DHBVDNA及ALTALANINEAMINOTRANSFERASE、ASTASPARTATEAMINTRANSFERASE的水平。用藥10天后，對(duì)肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果ΑDDBDU對(duì)HEPG2215的半數(shù)毒性濃度CC50為43616ΜM。不同濃度的該化合物（02ΜM、1ΜM、5ΜM）作用于細(xì)胞，能夠顯著的抑制S抗原和E抗原的分泌，抑制作用與時(shí)間和劑量呈正相關(guān)。ΑDDBDU濃度為5ΜM時(shí)，能夠有效地抑制HBVDNA的復(fù)制。藥物作用第九天，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DHBVDNA抑制率分別為8118％和8855％。給予不同劑量ΑDDBDU08，4，20MGKGD治療感染DHBV的鴨子，能夠顯著抑制DHBVDNA的復(fù)制。給藥10天，鴨血清和肝臟中DHBVDNA的抑制率分別達(dá)到9375％和8943％。此外，血清和肝臟中ALT、AST水平顯著下降，鴨肝臟的組織病理學(xué)結(jié)果表明ΑDDBDU對(duì)肝組織有明顯改善作用。結(jié)論ΑDDBDU對(duì)HBV的復(fù)制具有較強(qiáng)的抑制活性，并且對(duì)肝組織病理學(xué)具有顯著地改善作用。

簡(jiǎn)介：目的建立兔椎間盤(pán)退變模型檢測(cè)腺相關(guān)病毒ADENOASSOCIATEDVIRUS，AAV）介導(dǎo)的成骨蛋白1OP1和SOX9雙基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)兔退變椎間盤(pán)的生物學(xué)效應(yīng)。方法成年新西蘭大白兔通過(guò)針刺纖維環(huán)法建立椎間盤(pán)退變模型，造模后3周分別進(jìn)行MRI檢測(cè)，觀察造模椎間盤(pán)變化，確認(rèn)兔退變椎間盤(pán)模型造模成功。將造模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為五組N5，分別A組雙基因組（RAAV2HSOX9RAAV2HOP1）B組OP1組RAAV2HOP1C組SOX9組RAAV2HSOX9D組EGFP組RAAV2EGFPE組PBS對(duì)照組。分別于造模椎間盤(pán)髓核內(nèi)注射20ΜL雙基因組混合液（配制比例1∶1）、RAAVOP1、RAAVSOX9、RAAVEGFP、PBS磷酸鹽緩沖液，于手術(shù)后3、6、9周后行核磁共振掃描觀察退變椎間盤(pán)變化情況，同時(shí)取退變椎間盤(pán)組織，RTPCR方法觀察Ⅱ型膠原MRNA及蛋白多糖MRNA的變化。結(jié)果基因轉(zhuǎn)染后3周、6周、9周時(shí)，核磁共振掃描證實(shí)A、B、C組與D、E組，退變椎間盤(pán)T2加權(quán)像的信號(hào)強(qiáng)度明顯恢復(fù)，A組與B組、C組T2加權(quán)像的信號(hào)強(qiáng)度兩兩比較顯示具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005基因轉(zhuǎn)染后3周、6周、9周時(shí)，RTPCR法證實(shí)A組、B組、C組在不同轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了Ⅱ型膠原及蛋白多糖MRNA的表達(dá)，A組Ⅱ型膠原及蛋白多糖MRNA表達(dá)量均高于其他各組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005B、C組間Ⅱ型膠原MRNA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005B、C組間蛋白多糖MRNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。結(jié)論RAAV介導(dǎo)的SOX9及OP1雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)退變椎間盤(pán)組織有明顯的治療作用并且可以持續(xù)高效表達(dá)9周，有效的促進(jìn)退變椎間盤(pán)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成雙基因治療椎間盤(pán)退變具有協(xié)同效用SOX9基因可以明顯提高Ⅱ型膠原MRNA的表達(dá)，不能上調(diào)蛋白多糖MRNA的表達(dá)。

簡(jiǎn)介：目的本研究比較IL32在正常皮膚和病理性瘢痕組織中的表達(dá)及分布情況，探討IL32在病理性瘢痕的形成過(guò)程中所起的生物學(xué)作用及意義。同時(shí)，為進(jìn)一步研究病理性瘢痕的防治，構(gòu)建能表達(dá)人IL32的真核表達(dá)載體及含有人IL32基因介導(dǎo)的重組腺相關(guān)病毒載體，為下一步轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，觀察IL32基因在細(xì)胞中表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)的影響奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法1以正常皮膚作為對(duì)照，應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)IL32MRNA在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平。2以正常皮膚作為對(duì)照，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)IL32蛋白在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)及分布情況。3以正常皮膚作為對(duì)照，應(yīng)用WESTERNBLOTTING檢測(cè)IL32蛋白在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)及分布情況。4設(shè)計(jì)引物，合成目的片段IL32566BP。5原始質(zhì)粒TIL32的構(gòu)建及鑒定。6重組質(zhì)粒PSNAV20IL32的構(gòu)建及鑒定。7病毒包裝細(xì)胞BHK21的復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代，凍存。8構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒RAAV2IL32。9RAAV2IL32的大規(guī)模制備。10RAAV2IL32的目的基因的PCR鑒定。11RAAV2IL32的滴度測(cè)定。結(jié)果1RTPCR檢測(cè)IL32MRNA的結(jié)果正常皮膚、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中IL32MRNA均有表達(dá)。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩與正常皮膚相比較IL32MRNA的表達(dá)明顯降低P＜005），而增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中IL32MRNA的表達(dá)無(wú)明顯的差別P＞005）。2免疫組化檢測(cè)IL32蛋白結(jié)果IL32蛋白在三者中均有表達(dá)。但I(xiàn)L32蛋白在皮膚中表達(dá)較增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中強(qiáng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005而在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達(dá)無(wú)差異P＞005）。3WESTERNBLOTTING檢測(cè)IL32蛋白結(jié)果IL32蛋白在皮膚、增生瘢痕和瘢痕疙瘩三組中均有表達(dá)。與正常皮膚相比，增生性瘢痕及瘢痕疙瘩IL32蛋白的表達(dá)明顯降低P＜005。而在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達(dá)無(wú)差異（P＞005）。4應(yīng)用OVERLAPPINGPCR獲得目的基因片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增片斷約為570BP，與目的片斷大小基本符合，且無(wú)非特異性擴(kuò)增。5質(zhì)粒TIL32經(jīng)用BGLⅡ和KPNⅠ雙酶切酶切后電泳見(jiàn)大約570BP片段，與目的片斷符合。6PSNAV20IL32質(zhì)粒經(jīng)KPNⅠ和BGLⅡ雙酶切預(yù)期能產(chǎn)生大小分別71KB和570BP左右兩條帶而電泳結(jié)果與預(yù)期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確。720IL32質(zhì)粒轉(zhuǎn)染六孔板中的BHK21細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，取菌液經(jīng)PCR鑒定能夠特異地?cái)U(kuò)增出570BP左右大小的目的基因條帶。8RAAV2IL32大規(guī)模制備后，測(cè)病毒滴度約為521011VGML。結(jié)論1和正常皮膚相比，IL32MRNA和IL32蛋白增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有下降，提示IL32基因在病理性瘢痕組織的形成中起著重要作用，IL32基因可能通過(guò)各種機(jī)制影響病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展。預(yù)示IL32基因?qū)⒊蔀椴±硇择：刍蛑委熜碌暮蜻x靶基因。2成功構(gòu)建了能表達(dá)人IL32基因的真核表達(dá)載體。3構(gòu)建了有較強(qiáng)感染能力的含人IL32基因的重組腺相關(guān)病毒載體。

簡(jiǎn)介：背景SARSCONAVIRUSSARSCOV感染引起嚴(yán)重急性呼吸道綜合征SEVEREACUTERESPIRATYSYNDROME，SARS的全球爆發(fā)嚴(yán)重危害了人類(lèi)健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)。對(duì)SARSCOV的研究主要集中于病原的致病機(jī)制、SARS的源頭和傳播途、防治藥物和疫苗的研制和開(kāi)發(fā)。對(duì)于這種新現(xiàn)病毒，病毒抗原表位的研究是SARSCOV眾多研究的基礎(chǔ)。SARSCOVB細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位的確定及對(duì)其免疫學(xué)特性的研究將為SARS特異性診斷試劑的研制、疫苗和抗病毒藥物的設(shè)計(jì)與合成奠定基礎(chǔ)。目的篩選SARSCOVB細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，對(duì)其進(jìn)行特異性和敏感性檢測(cè)、抗體效價(jià)測(cè)定等一系列免疫學(xué)特性研究，分析各表位的潛在應(yīng)用前景，為SARS特異性診斷試劑、SARS疫苗和抗病毒藥物的研制奠定基礎(chǔ)。方法應(yīng)用隨機(jī)噬菌體展示肽庫(kù)，以SARS恢復(fù)期病人IGGFAB段及正常人IGGFAB段為篩選靶標(biāo)，經(jīng)改良的生物淘洗方式，結(jié)合生物信息學(xué)方法，篩選SARSCOV特異性B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位；人工合成表位多抗原肽MAPS，ELISA法檢測(cè)其特異性和敏感性；以表位肽免疫BALB／C小鼠，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)和特異性，研究表位肽誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答；經(jīng)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、ELISPOT分析IL4和IFNΓ分泌細(xì)胞數(shù)目變化、流式細(xì)胞技術(shù)分析脾淋巴細(xì)胞亞群變化和表位肽誘導(dǎo)CD4T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫記憶來(lái)研究表位肽誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答；經(jīng)吞噬功能的檢測(cè)研究表位肽誘導(dǎo)的非特異性免疫應(yīng)答；通過(guò)ELISA法和噬菌體滴度測(cè)定觀察表位介導(dǎo)的吸附作用以及特異性抗體對(duì)吸附的阻斷作用。結(jié)果1經(jīng)過(guò)2次4輪改良的生物淘洗，共篩選到9個(gè)SARSCOVS蛋白表位和2個(gè)M蛋白表位。2經(jīng)生物信息學(xué)分析，其中的7個(gè)表位即S91102、S424435、S458469、S785796、S10651076、M148159、M165176分別為SARSCOVS和M蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。合成6個(gè)表位MAP肽MAPLMAP6，分別為S91102、S424435、S458469、S10651076、M148159和M165176作進(jìn)一步研究。競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示各表位肽均可抑制相應(yīng)的噬菌體克隆與SARS恢復(fù)期病人IGGFAB段結(jié)合，最大抑制率為54％～86％，表明這些表位肽與其相應(yīng)的噬菌體克隆可不同程度地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗SARSCOVIGGFAB段的同一位點(diǎn)，證實(shí)了與抗SARSCOVIGGFAB段結(jié)合的表位肽的位點(diǎn)為SARSCOYB細(xì)胞表位。3免疫學(xué)特性研究1表位肽均能與SARS病人血清發(fā)生特異性反應(yīng)，不與正常人血清、抗人冠狀病毒OC43HCOVOC43血清和229EHCOV229E血清發(fā)生交叉反應(yīng)，具有SARSCOY特異性。與SARS病人血清反應(yīng)時(shí)，表位肽S458469，S91102，S10651076和M148159具有較高的敏感性。2表位肽誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答這些表位肽均能刺激小鼠產(chǎn)生高效價(jià)1∶1280～1∶5120特異性抗體，MAP1、MAP2、MAP4這3個(gè)S蛋白表位肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)高于M蛋白表位肽誘導(dǎo)者。這些抗體能特異地與SARSCOV滅活抗原反應(yīng)而不與HCOVOC43和HCOV229E抗原反應(yīng)。3表位肽誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答①免疫第14天，小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞明顯增生，T淋巴細(xì)胞相對(duì)減少，導(dǎo)致T／B比值明顯下降。隨T細(xì)胞增殖，T／B比值逐漸回復(fù)除MAP2組。發(fā)現(xiàn)MAP2免疫能引起短暫的T8細(xì)胞抑制，導(dǎo)致T4／T8比值明顯高于對(duì)照組，并于第21天恢復(fù)正常，其余多肽免疫組T4／T8與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，提示脾淋巴系統(tǒng)處于相對(duì)免疫穩(wěn)態(tài)。②首次免疫后8周，小鼠CD4T細(xì)胞出現(xiàn)CD44CD62L的記憶細(xì)胞表型，再次接觸相同抗原，MAP3免疫組CD4T細(xì)胞CD44表達(dá)輕微上調(diào)，其余組均輕微下調(diào)，隨后處于高表達(dá)狀態(tài)；CD62L表達(dá)連續(xù)上調(diào)，提示CD4T細(xì)胞免疫記憶形成。③各表位肽均可刺激淋巴細(xì)胞不同程度增生，最大刺激指數(shù)220％～476％。S蛋白表位肽刺激淋巴細(xì)胞增生的程度大于M蛋白表位肽刺激者。④各表位肽均能刺激IL4和IFNΓ分泌細(xì)胞增多，峰值分別為56～124個(gè)210個(gè)淋巴細(xì)胞和14～20個(gè)210個(gè)淋巴細(xì)胞，前者明顯多于后者。S蛋白表位肽刺激IL4分泌細(xì)胞多于M蛋白表位肽刺激者。4表位肽誘導(dǎo)的非特異性免疫應(yīng)答各表位肽均能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。5展示SARSCOVS91102、S424435和S458469表位的噬菌體可不同程度地吸附VERO，VEROE6，MDCK，HEP2細(xì)胞，其特異性抗體可阻斷表位介導(dǎo)的吸附作用。結(jié)論本研究以SARS恢復(fù)期病人血清為篩選材料，應(yīng)用噬菌體展示肽技術(shù)，通過(guò)改良的生物淘洗方法，篩選出9個(gè)SARSCOVS蛋白表位和2個(gè)M蛋白表位，表明SARSCOVS蛋白和M蛋白為SARSCOV的重要抗原成分。結(jié)合生物信息學(xué)方法在篩得的11個(gè)表位中選擇6個(gè)優(yōu)勢(shì)表位，以ELISA、ELISPOT、流式細(xì)胞技術(shù)等免疫學(xué)方法研究這些表位的免疫學(xué)特性，結(jié)論如下各表位肽誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答以體液免疫為主，刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)抗體，證實(shí)這些表位為B細(xì)胞表位；其中S蛋白表位肽誘導(dǎo)的特異性抗體效價(jià)高于M蛋白表位肽誘導(dǎo)者，提示它們?cè)诒砦灰呙缁蛞呙缪兄浦械臐撛趹?yīng)用前景；所篩表位具有SARSCOV特異性，其中S458469、S91102、S10651076和M148159具有較高的敏感性，此外，抗表位肽抗體具有特異性，可通過(guò)制備高效價(jià)免疫血清或單克隆抗體MCAB用于特異性診斷，提示了這些表位在研制特異性診斷試劑中的潛在應(yīng)用價(jià)值；表位S91102、S424435和S458469可介導(dǎo)噬菌體對(duì)SARSCOV宿主細(xì)胞的吸附，其特異性抗體可阻斷吸附作用，提示它們可能為研究保護(hù)性疫苗和抗病毒藥物的潛在靶點(diǎn)。

簡(jiǎn)介：流感是一種流感病毒引起的嚴(yán)重性呼吸道疾病。流感病毒INFLUENZAVNS，IV具有高度傳染性，能在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行，導(dǎo)致全球人力資源和物力資源的重大損失。流感病毒的主要表面抗原之一血凝素HA，具有高度變異性，致使流感病毒疫苗一般每年都要更換，給疫苗的制備和生產(chǎn)造成了諸多不便。而流感病毒的跨膜蛋白一基質(zhì)蛋白2M2蛋白，含有高度保守的抗原表位，是病毒亞型間交叉保護(hù)性疫苗的候選抗原。流感病毒變異速度非常快，尤其是當(dāng)前禽流感病毒逐漸蔓延到人群中，對(duì)人類(lèi)危害越來(lái)越大，因此研制出一種新穎的具有廣泛保護(hù)作用的疫苗對(duì)于控制流感病毒流行具有極其重要的意義。本研究選擇了A型流感病毒的缺失跨膜區(qū)M2以及H1N1和H3N2亞型流感病毒HA的7個(gè)保守的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。采用大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子對(duì)M2外膜區(qū)基因和HA多表位基因進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。通過(guò)合成引物，利用重疊延伸PCROEPCR和搭橋式PCR方法分別擴(kuò)增得到A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜區(qū)基因和HA多表位基因，依次克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28AM2DHA，經(jīng)測(cè)序表明，插入表達(dá)載體中的外源基因的序列與理論設(shè)計(jì)的基因序列完全一致。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3，篩選獲得了高效表達(dá)重組融合蛋白的工程菌，表達(dá)重組蛋白約占菌體總蛋白總量的45％左右。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)包涵體處理，親和層析純化后，重組蛋白稀釋復(fù)性，再經(jīng)陰離子交換層析純化得到純度在90％以上的目的蛋白。WESTEMBLOT結(jié)果顯示純化的重組蛋白具有較好的抗原性和特異性。重組蛋白免疫小鼠后，利用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白在小鼠體內(nèi)獲得了很高的抗體免疫水平；利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察，重組蛋白抗血清對(duì)MDCK細(xì)胞上的流感病毒能夠產(chǎn)生很好的抗原性。本研究成功構(gòu)建了流感病毒M2DHA抗原多表位重組蛋白表達(dá)載體，在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)；通過(guò)基因工程獲取較高純度的M2DHA重組蛋白，同時(shí)對(duì)蛋白表達(dá)、純化復(fù)性等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了初步的探索；在昆明小鼠體內(nèi)，對(duì)該重組蛋白的免疫學(xué)效應(yīng)作了初步的研究，為進(jìn)一步研究廣譜型流感病毒亞單位疫苗提供了很好的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)資料，也為流感病毒亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)及基礎(chǔ)研究奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)建立體外病毒性心肌炎VMC細(xì)胞模型，研究廣棗總黃酮TFCA的體外抗柯薩奇B組3型病毒CVB3作用及其作用機(jī)制，探究其作用靶點(diǎn)，為T(mén)FCA進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。方法采用差速貼壁法培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞，鏡下觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)，使用ΑACTIN免疫組化法鑒定培養(yǎng)心肌細(xì)胞的純度；在細(xì)胞水平測(cè)定陽(yáng)性藥鹽酸胍以及廣棗總黃酮的藥物毒性；以CVB3感染心肌細(xì)胞建立病毒性心肌炎細(xì)胞模型；MTT染色分析廣棗總黃酮對(duì)病毒感染后的HELA細(xì)胞及心肌細(xì)胞是否有保護(hù)作用；病毒繁殖抑制實(shí)驗(yàn)比較不同分組間TCID50的差別以驗(yàn)證廣棗總黃酮在HELA細(xì)胞及心肌細(xì)胞上的抗病毒活性；測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中心肌酶LDH、CKMB的變化；測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子TNFΑ含量的變化；運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)病毒相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)過(guò)在HELA細(xì)胞及心肌細(xì)胞水平的初篩，確定廣棗總黃酮具有保護(hù)心肌細(xì)胞免受CVB3病毒侵襲的作用。病毒繁殖抑制實(shí)驗(yàn)顯示廣棗總黃酮的高、中劑量組TCID50與病毒對(duì)照組TCID50相差一個(gè)以上對(duì)數(shù)值；廣棗總黃酮能使心肌酶LDH、CKMB的釋放較病毒組顯著降低P＜005，還可抑制被病毒感染的心肌細(xì)胞TNFΑ的分泌；同時(shí)，廣棗總黃酮還可明顯抑制CVB3相關(guān)基因CMYC、TNFΑ、FAS的表達(dá)。結(jié)論通過(guò)建立病毒性心肌炎細(xì)胞模型，證實(shí)廣棗總黃酮在體外細(xì)胞培養(yǎng)物上具有抗CVB3病毒作用。

簡(jiǎn)介：戊型肝炎HEPATITISE，HE是由戊型肝炎病毒HEPATITISEVIRUS，HEV引起的一種急性病毒性肝炎，主要經(jīng)糞一口途徑傳播，常因飲用水源被污染而導(dǎo)致暴發(fā)流行，散發(fā)病例呈現(xiàn)全球分布。在我國(guó)的很多地區(qū)都有HEV感染的報(bào)道，HE流行率在我國(guó)為172％左右，各省市分布不均，農(nóng)村HEV感染率高于城市。根據(jù)HEV各分離株基因序列的核苷酸同源性、氨基酸同源性的大小以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析，目前將世界上HEV主要分為4個(gè)基因型。臨床上急性HEV感染率占總?cè)丝诘?5％～1％，感染率隨年齡增加而增加，20歲左右達(dá)到感染高峰，發(fā)病者主要為青壯年，其臨床表現(xiàn)主要是肝炎病毒引起的黃疸、急性肝壞死等。一般呈良性經(jīng)過(guò)，但孕婦感染情況較重，死亡率高達(dá)15％N25％，是一種全國(guó)普遍流行、危害比較嚴(yán)重的疾病。HEV是無(wú)包膜單股正鏈RNA病毒。HEV基因組全長(zhǎng)約72～76KB，由5’和3’非結(jié)構(gòu)區(qū)及3個(gè)相互重疊的編碼閱讀框OPENREADINGFRAMESFF1，F(xiàn)2和F3組成，基因組結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。其中F2編碼病毒衣殼蛋白，富含HEV重要抗原表位。HEV組織培養(yǎng)研究尚不成熟，目前的診斷主要是采用間接酶聯(lián)免疫吸附分析ELISA方法檢測(cè)血清中的抗體。但因?yàn)镠EV感染窗口期或患者自身免疫功能以及檢測(cè)方法的特異性等原因都會(huì)給HEV診斷帶來(lái)不確定性；HEVRNA檢測(cè)是目前判斷HEV是否存在的標(biāo)準(zhǔn)之一，但由于HEV存在多種基因型，給臨床研究工作和疫苗的研制帶來(lái)了很多困難。鑒于此，本課題建立了一種快速、敏感、特異性強(qiáng)的巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)NESTREVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTION，NRTPCR方法，用于血清HEVRNA的定性檢測(cè)，并探討其在輔助臨床進(jìn)行戊型肝炎早期診斷中的價(jià)值。研究目的1、了解近年戊型肝炎病毒感染患者的臨床特征及血清學(xué)特點(diǎn)；分析比較單純感染和重疊感染的戊型肝炎患者的血清學(xué)特征異同，闡明重疊感染的戊型肝炎患者病情的發(fā)展及預(yù)后情況。為HEV的臨床診治和進(jìn)一步研究提供參考。2、建立巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增血清HEVRNA方法，評(píng)價(jià)其應(yīng)用于急性戊型肝炎患者血清HEVRNA檢測(cè)的臨床意義。研究方法1、收集667例戊型肝炎病毒HEV感染以及戊型肝炎病毒重疊感染患者的相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)并與乙型肝炎病毒HBV感染、丙型肝炎病毒HCV感染患者進(jìn)行回顧性資料分析。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2000年西安中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“病毒型肝炎防治方案”中的病毒型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。凡抗HEVIGM和或抗HEVIGG陽(yáng)性，并具有急性病毒性肝炎的臨床表現(xiàn)和肝功能異常者，診斷為急性戊型肝炎。2、對(duì)GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中的戊型肝炎病毒全基因組序列進(jìn)行分析比對(duì)，并針對(duì)國(guó)內(nèi)流行的戊型肝炎病毒株序列，選擇位于F2的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立NRTPCR方法，并檢測(cè)126例急性戊型肝炎患者、20例甲型肝炎患者、30例乙型肝炎患者和30例丙型肝炎患者血清中戊型肝炎病毒RNA，以30例健康獻(xiàn)血者作為對(duì)照組。全部樣品提取RNA后進(jìn)行NRTPCR檢測(cè)HEVRNA，并與檢測(cè)抗HEVIGM的方法進(jìn)行比較。研究結(jié)果1、HEV感染病例多分布在21～40歲年齡段；且女性多于男性。在HEV陽(yáng)性患者中，青少年組與青年組、中年組，老年組在ALP項(xiàng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。老年組HEV感染患者的各項(xiàng)指標(biāo)都處于較高水平；HEV重疊感染患者的年齡高峰都是在21～40歲之間，低年齡組與高年齡組的多重感染率均較低。HEV感染組與HEVHBV重疊感染組比較，ALP、TBIL存在明顯差別，膽汁淤積增多，黃疸程度加深。HEV感染組與HEVHCV重疊感染組LDH差異顯著，肝細(xì)胞損傷明顯。2、126例急性戊型肝炎患者血清中有67例532％HEVRNA陽(yáng)性。對(duì)照組血清HEVRNA檢測(cè)均為陰性。與血清抗HEVIGM檢測(cè)結(jié)果比較，HEVRNA檢測(cè)的總符合率為8091％102126，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。NRTPCR方法檢測(cè)HEVRNA與血清抗HEVIGM檢測(cè)方法存在明顯的差異，不能相互替代，而有一定的互補(bǔ)性。3例患者的首份血清檢測(cè)為HEVRNA陽(yáng)性，但抗HEVIGM為陰性，系列追蹤檢測(cè)，都相繼出現(xiàn)抗HEVIGM。急性戊型肝炎患者血清HEVRNA的檢出多在發(fā)病的1～12天內(nèi)。研究結(jié)論1、HEV主要侵犯青壯年，隨著年齡的增長(zhǎng)重疊感染的比例越高。老年人感染HEV的肝功能損害比年輕人嚴(yán)重；HEV陽(yáng)性女性患者所占比例較多HEV重疊HBV感染后肝細(xì)胞損害加重，病情趨向重癥化。2、應(yīng)用巢式RTPCR方法能對(duì)急性散發(fā)戊型肝炎患者血清中的HEVRNA進(jìn)行定性檢測(cè)，且有較高的特異性和敏感性。在臨床使用可以提高對(duì)HEV早期診斷的水平，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建腸道病毒71型雙中和抗原表位嵌合型人3型腺病毒載體，為人3型腺病毒衣殼嵌合載體的應(yīng)用及基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。方法以前期構(gòu)建的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒PBRAD△E3GFPSP70為模板，搭橋PCR擴(kuò)增六鄰體不同超變區(qū)（HVR）同時(shí)嵌入EV71的SP55和SP70兩個(gè)中和表位的六鄰體突變基因片段HEXONSP55SP70，突變的六鄰體片段克隆入穿梭載體，酶切后與線(xiàn)性化的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒PBRAD△E3GFP共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，同源重組獲得陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒PBRSP70SP55AD3EGF，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定并線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞拯救重組腺病毒。重組腺病毒經(jīng)大量擴(kuò)增純化后，進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和生長(zhǎng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分析病毒的特性，WESTERNBLOT和ELISA實(shí)驗(yàn)分析嵌合表位在六鄰體上的表達(dá)及在重組腺病毒粒子表面的暴露情況之后，用重組腺病毒免疫BALBC小鼠，通過(guò)WESTERNBLOT，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠的體液免疫反應(yīng)，微量中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗血清體外中和EV71病毒的活性。結(jié)果在SP70嵌入六鄰體HVR1區(qū)的基礎(chǔ)上，SP55嵌入六鄰體HVR4區(qū)和HVR5區(qū)的重組腺病毒質(zhì)粒未能成功拯救出重組病毒，而SP55嵌入HVR2區(qū)成功拯救出重組腺病毒R1R2A3，而且沒(méi)有影響病毒的熱穩(wěn)定性和生長(zhǎng)特性。SP55、SP70表位在六鄰體蛋白融合表達(dá)并且暴露在病毒粒子表面。重組腺病毒初次免疫小鼠即誘導(dǎo)出SP55、SP70表位特異性抗體，多次免疫后抗體應(yīng)答加強(qiáng)。重組腺病毒較SP70GST，SP55GST融合蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高滴度的IGG抗體，并且重組腺病毒免疫的抗血清能夠體外中和EV71病毒感染。結(jié)論成功構(gòu)建表達(dá)雙中和抗原表位嵌合型人3型重組腺病毒，免疫小鼠后誘導(dǎo)出表位特異的體液免疫反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)拓寬了六鄰體衣殼蛋白修飾的3型腺病毒作為多個(gè)外源表位展示載體工具的應(yīng)用，為其以后應(yīng)用于雙價(jià)或者多價(jià)疫苗打下了良好的基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：研究目的通過(guò)體內(nèi)外抗乙肝病毒實(shí)驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)中藥復(fù)方清肝排毒飲抗乙肝病毒的作用效果；通過(guò)抗免疫性肝損傷和化學(xué)性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)該復(fù)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用效果并探討其作用機(jī)制，為清肝排毒飲應(yīng)用于臨床治療慢性乙型肝炎進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、復(fù)方清肝排毒飲對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)在小鼠急性毒性試驗(yàn)研究，我們通過(guò)記錄動(dòng)物中毒表現(xiàn)及死亡情況，測(cè)定不同濃度的清肝排毒飲對(duì)小鼠的毒副作用，從而確定試驗(yàn)的劑量范圍。結(jié)果顯示，復(fù)方清肝排毒飲80GKGD劑量可能對(duì)小鼠影響較大，而40GKGD劑量下對(duì)小鼠可能影響較小，故本課題以下實(shí)驗(yàn)所用劑量均在40GKGD劑量范圍以下進(jìn)行。2、復(fù)方清肝排毒飲體內(nèi)外抗乙肝病毒實(shí)驗(yàn)研究在體內(nèi)抗DHBV的實(shí)驗(yàn)研究中，選擇由先天感染性鴨乙肝病毒為模型。分別于T、T、T、P各時(shí)間點(diǎn)采血，分離血清，用斑點(diǎn)雜交法測(cè)定血清中DHBV的載量變化。結(jié)果顯示，清肝排毒飲大、中劑量組均有不同程度抑制DHBVDNA作用，與拉米夫定組相比較無(wú)顯著差異性，停藥后反跳不明顯。在體外抗HBV的實(shí)驗(yàn)研究中，采用2215細(xì)胞模型，以HBSAG、HBEAG作為藥物效果檢測(cè)指標(biāo)，并用MTT法檢測(cè)藥物細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，清肝排毒飲對(duì)2215細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC為4023MGML。復(fù)方清肝排毒飲對(duì)HBSAG，HBEAG的半數(shù)抑制濃度IC分別為145和074，顯示清肝排毒飲在體外無(wú)顯著的直接抑制乙肝病毒復(fù)制的作用。3、復(fù)方清肝排毒飲體內(nèi)抗免疫性肝損傷和化學(xué)性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究體內(nèi)抗免疫性肝損傷作用研究采用刀豆蛋白ACONA所誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，用清肝排毒飲大、小劑量組40GKG，20GKG進(jìn)行治療，并與聯(lián)苯雙酯治療組為對(duì)照，檢測(cè)小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT、腫瘤壞死因子TNFΑ和Γ干擾素IFNΓ含量，觀察肝組織病理改變。清肝排毒飲大劑量組小鼠ALT活性、IFNΓ和TNFΑ含量均明顯低于模型組，差異有顯著性意義P005；清肝排毒飲大劑量組肝臟病理改變明顯減輕。表明清肝排毒飲對(duì)CONA所致小鼠肝損傷具有較好的保護(hù)作用，抑制T淋巴細(xì)胞活化和IFNΓ、TNFΑ的釋放是其主要的作用機(jī)制。體內(nèi)抗化學(xué)肝損傷作用研究采用醋氨酚所導(dǎo)致的小鼠肝損傷模型，用清肝排毒飲大、中、小劑量組80GKG，40GKG，20GKG進(jìn)行治療，并與聯(lián)苯雙酯治療組對(duì)照，檢測(cè)小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽GSH水平，觀察肝組織病理改變。清肝排毒飲大、中劑量組能顯著抑制小鼠血清ALT，升高SOD、GSH水平，與模型組比較，差異有顯著性意義P005；清肝排毒飲大、中劑量組肝臟病理改變明顯減輕。表明清肝排毒飲對(duì)醋氨酚所致小鼠化學(xué)性肝損傷具有較好的保護(hù)作用，作用機(jī)制與抗氧自由基損傷有關(guān)。結(jié)論清肝排毒飲有較好的抗鴨乙肝病毒和抗實(shí)驗(yàn)性肝損傷作用，有著較好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。