腸道病毒71型雙中和抗原表位嵌合型人3型腺病毒載體的免疫學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建腸道病毒71型雙中和抗原表位嵌合型人3型腺病毒載體，為人3型腺病毒衣殼嵌合載體的應(yīng)用及基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　以前期構(gòu)建的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒pBRAd△E3GFP-sp70為模板，搭橋PCR擴增六鄰體不同超變區(qū)（HVR）同時嵌入EV71的SP55和SP70兩個中和表位的六鄰體突變基因片段 hexon-sp55sp70，突變的六鄰體片段克隆入穿梭載體，酶切后與線性化的人3型腺病毒骨

2、架質(zhì)粒 pBRAd△E3GFP共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BJ5183，同源重組獲得陽性重組腺病毒質(zhì)粒 pBRsp70sp55Ad3egf，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定并線性化后轉(zhuǎn)染AD293細胞拯救重組腺病毒。重組腺病毒經(jīng)大量擴增純化后，進行熱穩(wěn)定性實驗和生長穩(wěn)定性實驗分析病毒的特性，Western blot和ELISA實驗分析嵌合表位在六鄰體上的表達及在重組腺病毒粒子表面的暴露情況之后，用重組腺病毒免疫BALB/c小鼠，通過Western blo

3、t，ELISA實驗檢測免疫小鼠的體液免疫反應(yīng)，微量中和實驗檢測抗血清體外中和EV71病毒的活性。
　　結(jié)果:
　　在 SP70嵌入六鄰體 HVR1區(qū)的基礎(chǔ)上，SP55嵌入六鄰體HVR4區(qū)和HVR5區(qū)的重組腺病毒質(zhì)粒未能成功拯救出重組病毒，而SP55嵌入HVR2區(qū)成功拯救出重組腺病毒R1R2A3，而且沒有影響病毒的熱穩(wěn)定性和生長特性。SP55、SP70表位在六鄰體蛋白融合表達并且暴露在病毒粒子表面。重組腺病毒初次免疫小鼠即誘導(dǎo)

4、出SP55、SP70表位特異性抗體，多次免疫后抗體應(yīng)答加強。重組腺病毒較SP70-GST，SP55-GST融合蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高滴度的IgG抗體，并且重組腺病毒免疫的抗血清能夠體外中和EV71病毒感染。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建表達雙中和抗原表位嵌合型人3型重組腺病毒，免疫小鼠后誘導(dǎo)出表位特異的體液免疫反應(yīng)，本實驗拓寬了六鄰體衣殼蛋白修飾的3型腺病毒作為多個外源表位展示載體工具的應(yīng)用，為其以后應(yīng)用于雙價或者多價疫苗打下