登革熱病毒抗原表位嵌合型人3型腺病毒載體構(gòu)建及免疫學(xué)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建人3型腺病毒載體嵌入登革熱病毒抗原表位的重組腺病毒，為人3型腺病毒衣殼嵌合載體的應(yīng)用及登革熱病毒疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:人3型腺病毒骨架質(zhì)粒pBRAd△E3GFP為模板，搭橋PCR擴(kuò)增六鄰體不同超變區(qū)（HVR）嵌入不同血清型登革病毒抗原表位的六鄰體突變基因片段hexon-DENV，突變的六鄰體片段酶切后克隆到穿梭載體。穿梭質(zhì)粒酶切后與線性化的pBRAd△E3GFP電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，鑒定后獲

2、得陽性重組腺病毒質(zhì)粒pBRAd△E3GFP-DENV。經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定登革病毒抗原表位正確插入相應(yīng)HVR后，中抽質(zhì)粒并酶切線性化后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞包裝重組腺病毒。成功包裝的重組腺病毒經(jīng)大量擴(kuò)增培養(yǎng)及純化后，進(jìn)行熱穩(wěn)定性和生長(zhǎng)曲線分析，Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)分析嵌合的登革病毒抗原表位在六鄰體上表達(dá)及在重組腺病毒粒子表面的暴露情況。重組腺病毒免疫BALB/c小鼠，通過Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免

3、疫小鼠對(duì)重組腺病毒的體液免疫反應(yīng)，微量中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗血清體外中和登革病毒的作用。
　　結(jié)果:通過搭橋PCR擴(kuò)增出HVR1嵌入登革病毒1型抗原表位、HVR2插入登革病毒3型抗原表位，HVR5嵌入登革病毒2型抗原表位的突變六鄰體片段。成功將突變的六鄰體片段克隆到穿梭載體后酶切線性化，與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組后，獲得四個(gè)重組腺病毒質(zhì)粒。在AD293細(xì)胞中成功包裝出在六鄰體HVR1嵌入登革病毒1型抗原表位和在HVR2嵌入登革病毒3

4、型抗原表位的重組腺病毒Ad3-R1DENV1和Ad3-R2DENV3，在六鄰體HVR5區(qū)的嵌入登革病毒2型抗原表位的重組腺病毒質(zhì)粒未能成功包裝出重組病毒。重組腺病毒的熱穩(wěn)定性和生長(zhǎng)特性不受插入登革病毒抗原表位影響。登革病毒1型和3型抗原表位在六鄰體蛋白融合表達(dá)并且暴露在病毒粒子表面。Western blot，ELISA結(jié)果顯示重組腺病毒免疫小鼠即誘導(dǎo)登革病毒表位特異性抗體。體外中和實(shí)驗(yàn)中，重組腺病毒免疫的小鼠血清對(duì)登革病毒感染C6/36