單純皰疹病毒Ⅱ型CTL表位gD DNA疫苗的構(gòu)建及免疫學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、生殖器皰疹(genitalherpes，GH)主要由單純皰疹病毒Ⅱ型(HerpesSimplexVirusⅡ，HSV-2)感染所致。GH近年來發(fā)病率明顯上升，是當(dāng)前全球范圍內(nèi)對(duì)人類健康危害較嚴(yán)重的性傳播疾病。HSV-2初發(fā)感染后，感染者易終生攜帶病原體，并以潛伏感染的形式局限在感覺神經(jīng)后根。該病易復(fù)發(fā)，目前尚無徹底治愈的方法，且發(fā)病率逐年上升。研制有效的生殖器皰疹病毒疫苗，是預(yù)防和治療單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)感染的關(guān)鍵。近年來，新

2、型的DNA疫苗由于能誘導(dǎo)出較好的細(xì)胞免疫和體液免疫而日益受到重視。 為研制有效安全，免疫原性好的疫苗，各國學(xué)者一直不斷地探討，本研究針對(duì)Ⅱ型單純皰疹病毒(HSV-2)包膜糖蛋白gD以及包膜糖蛋白gB的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)表位，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-gD-CTL。研究重組質(zhì)粒pVAX-gD-CTL在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)，評(píng)價(jià)其激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，特別是細(xì)胞免疫反應(yīng)的應(yīng)答

3、。 首先根據(jù)GeneBank提供的HSV-2333株糖蛋白D基因(gD)序列設(shè)計(jì)PCR引物，以已構(gòu)建好的pc-gD為模板，特異性擴(kuò)增HSV-2gD片段，將其克隆于pVAX1載體中構(gòu)建質(zhì)粒pVAX-gD，再將其雙酶切后引入CTL片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX-gD-CTL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽性克隆進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-gD-CTL轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS-7，免疫組化、蛋白電泳及免疫印跡方法鑒定重組質(zhì)粒的表達(dá)

4、情況。 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-gD-CTL肌注免疫BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)pVAX-gD-CTL可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度gDIgG。ELISA法檢測(cè)γ干擾素(interferon，IFN-γ)結(jié)果表明該重組質(zhì)粒免疫小鼠后對(duì)機(jī)體刺激產(chǎn)生INF-γ，提示能刺激病毒感染細(xì)胞表達(dá)MHC-I類分子，對(duì)細(xì)胞免疫具有明顯促進(jìn)作用。ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素4(interleukin，IL-4)結(jié)果表明該重組質(zhì)粒對(duì)體液免疫的促進(jìn)作用與陽性對(duì)照pV

5、AX-gD質(zhì)粒相比差異不顯著。MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示pVAX-gD-CTL具有一定的刺激脾淋巴細(xì)胞增殖能力。CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群分析結(jié)果顯示，該重組質(zhì)粒刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生CD4+T與CD8+T細(xì)胞數(shù)量均有升高，但CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值結(jié)果顯示pVAX-gD-CTL組較陽性對(duì)照pVAX-gD組相比差異無顯著意義，提示重組質(zhì)粒pVAX-gD-CTL與陽性對(duì)照pVAX-gD質(zhì)粒對(duì)刺激機(jī)體CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量

6、升高程度相當(dāng)。 本研究中所選的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1是目前唯一符合FDA標(biāo)準(zhǔn)的DNA疫苗專用載體，選擇HSV-2糖蛋白gD基因片段和糖蛋白gB的CTL表位作為構(gòu)建重組DNA疫苗的保護(hù)性抗原編碼基因。HSV包膜糖蛋白gD是抗HSV感染中最重要的保護(hù)性抗原，含有g(shù)D目的基因的疫苗在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原，模擬自然感染狀態(tài)，對(duì)CD4+輔助性T細(xì)胞及CD8+殺傷性T細(xì)胞均有激活作用，能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫及體液免疫，引起高滴度的中和抗體，激發(fā)遲發(fā)超敏反

7、應(yīng)及細(xì)胞增殖反應(yīng)，保護(hù)動(dòng)物免受HSV的攻擊，抑制隱性感染的發(fā)生。CTL表位是內(nèi)源性抗原經(jīng)APC加工及MHC提呈給TCR的短肽，是介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部位。可誘導(dǎo)MHC-I限制的CD8+T細(xì)胞的CTL反應(yīng)和MHC-Ⅱ限制的CD4+T細(xì)胞的Th1反應(yīng)，并能激活B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體。 本研究將gD目的基因的抗原優(yōu)勢(shì)片斷與CTL表位聯(lián)合構(gòu)建到pVAX1載體上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該重組DNA疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度中和抗體，刺激高水平INF-γ產(chǎn)生