單純皰疹病毒2型gD模擬抗原表位的篩選及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的： (1)用噬菌體展示技術(shù)篩選HSV-2gD的模擬抗原表位； (2)對(duì)篩選的結(jié)果應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAStar protean進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位的分析，進(jìn)一步確定HSV-2gD的模擬抗原表位； (3)構(gòu)建人IL-18真核表達(dá)載體； (4)構(gòu)建HSV-2gD模擬抗原表位的真核表達(dá)載體。 方法： (1)以HSV-2gD單克隆抗體作為固相篩選蛋白，對(duì)噬菌體12肽庫(kù)進(jìn)行4輪“

2、吸附-洗脫-擴(kuò)增”的生物篩選，挑取噬斑，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)鑒定陽(yáng)性噬菌體克隆，提取陽(yáng)性噬菌體的單鏈DNA，進(jìn)行測(cè)序，并分析結(jié)果； (2)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAStar protean對(duì)篩選的結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位的分析，進(jìn)一步確定HSV-2gD的模擬抗原表位； (3)TRIZOL法提取丙型肝炎病人肝臟組織的總RNA，應(yīng)用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成eDNA； (4)以p

3、cDNA3.1-作為真核表達(dá)載體，應(yīng)用DNAStar和Primer Pream軟件設(shè)計(jì)兩個(gè)目的基因的引物，即人IL-18和HSV-2gD模擬抗原表位； (5)應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：人IL-18和HSV-2gO模擬抗原表位，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果； (6)應(yīng)用基因工程技術(shù)將兩個(gè)目的片段分別克隆到PMD-18 T simple vector中； (7)將兩個(gè)目的基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1-中

4、，構(gòu)建DNA疫苗。 結(jié)果： (1)通過(guò)四輪特異性淘洗，篩選得到11個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆，提取噬菌體單鏈DNA測(cè)序，從測(cè)序結(jié)果可以看出共有7個(gè)序列的同源性較高，其中有兩個(gè)氨基酸基序即P*PLW和PYH**H出現(xiàn)的機(jī)率較高，可能為HSV-2gD的模擬抗原表位； (2)生物信息學(xué)軟件分析兩個(gè)氨基酸基序的代表：即短肽P3和P6，可以確定兩者均具有形成模擬抗原表位的可能性； (3)成功擴(kuò)增了兩個(gè)目的片段：600bp左右