DNA疫苗Prsc-Gd-IL-21的構(gòu)建及其預(yù)防單純皰疹病毒性角膜炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、單純皰疹病毒性角膜炎(Herpes Simplex Keratitis,HSK)是由單純皰疹病毒(HSV)感染引起的一種常見眼角膜疾病,主要由HISV-1型引起,它病情遷延、易復(fù)發(fā),終身不愈,是角膜病中首要的致盲原因。目前其主要的治療方法為全身及局部抗病毒治療,能使病情得到不同程度的控制,但遠(yuǎn)沒有達(dá)到根治及控制傳播;并且長(zhǎng)期服藥存在副反應(yīng)及藥物耐受等問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者均認(rèn)為,誘導(dǎo)針對(duì)病毒的特異性免疫是最終控制HSK的最有效途徑,因此抗

2、HSK疫苗的研制是當(dāng)今重要的研究方向。
　　 HSV-1是具有包膜的病毒,包膜上含有多種糖蛋白,都具有不同的免疫原性,其中以糖蛋白D(gD)和糖蛋白B(gB)尤為重要,它們是HSV-1主要的免疫原。
　　 多年來(lái),針對(duì)HSK的疫苗研究取得了一些成果,很多疫苗應(yīng)用到動(dòng)物體內(nèi),起到一定的效果,但到目前為止,尚無(wú)有效疫苗應(yīng)用到臨床。DNA疫苗被認(rèn)為是疫苗研制的革新,這種疫苗接種后,DNA靶基因編碼的蛋白抗原在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá),其

3、加工處理過(guò)程與病毒感染的自然過(guò)程相似,抗原提呈過(guò)程也相同,從而以自然的形式被加工后以天然構(gòu)象提呈給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng),激發(fā)較強(qiáng)的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答。
　　 設(shè)計(jì)合適的疫苗佐劑以進(jìn)一步增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性從而提高免疫效應(yīng),將對(duì)該類疫苗的研制與實(shí)際應(yīng)用起著十分重要的作用。細(xì)胞因子分子佐劑是近來(lái)倍受關(guān)注的一種疫苗佐劑。白細(xì)胞介素21(IL-21)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子,它是一種較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)因子,具有多重生物學(xué)效應(yīng)。在非特異

4、性免疫應(yīng)答方面,IL-21可促進(jìn)NK細(xì)胞分化并表達(dá)CD16分子,從而使之具有抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)作用;在體液免疫方面,IL-21能協(xié)同活化B細(xì)胞;在細(xì)胞免疫方面,IL-21可增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。
　　 DNA疫苗的接種途徑同樣影響疫苗的免疫效果。眼表面和其它粘膜組織一樣具有粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT),它構(gòu)成了眼表粘膜免疫系統(tǒng)(OMIS),具有局部攝取外來(lái)抗原,刺激B細(xì)胞、T細(xì)胞增殖,在眼表局部產(chǎn)生特異性

5、細(xì)胞及體液免疫反應(yīng),如分泌高效slgA等。HSK正是一種眼表粘膜感染性疾病,對(duì)于這一類疾病,采取眼表粘膜接種DNA疫苗,相對(duì)于全身系統(tǒng)接種而言,可以在眼局部產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞及體液免疫。
　　 對(duì)于DNA疫苗的粘膜接種,如何提高它在粘膜表面的停留時(shí)間、對(duì)粘膜的滲透性、對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率以及減少DNA的降解是至關(guān)重要的,尤其對(duì)于眼表面粘膜:因眼有不斷的瞬目動(dòng)作,從而清除停留在眼表粘膜的物質(zhì)。解決此問(wèn)題最好的辦法是增加合適的DNA疫苗載體

6、輸送系統(tǒng)。納米基因載體是近些年發(fā)展的新型基因載體,它具有無(wú)免疫原性、能提高疫苗的吸收度及生物利用度,減少DNA的降解以及毒副作用低等突出優(yōu)點(diǎn),并且尤其能提高局部粘膜免疫水平。
　　 據(jù)此,本研究選擇gD作為疫苗的主要免疫原,IL-21作為新型細(xì)胞因子疫苗分子佐劑,采用經(jīng)典基因克隆方法,構(gòu)建了DNA疫苗質(zhì)粒pRSC-gD-IL-21,經(jīng)酶切、測(cè)序、RT-PCR真核細(xì)胞目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及Western Blot目的蛋白表達(dá)鑒定后,

7、結(jié)果證明構(gòu)建成功;并將其免疫小鼠,相對(duì)于對(duì)照疫苗pRSC-gD等,誘導(dǎo)了明顯較強(qiáng)的小鼠抗病毒特異性的細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答以及非特異性的NK細(xì)胞殺傷活性;同時(shí),在HSK小鼠模型研究中,疫苗pRSC-gD免疫鼠HSK的病情雖亦有所緩解,但疫苗pRSC-gD-IL-21免疫鼠HSK的病情程度及持續(xù)時(shí)間明顯輕于前者。上述結(jié)果表明IL-21增強(qiáng)了疫苗抗病毒的細(xì)胞免疫、體液免疫以及非特異性固有免疫,是一種良好的新型抗病毒DNA疫苗分子佐劑。
　

8、　 其次,我們比較了肌肉系統(tǒng)接種與眼表粘膜接種(局部滴眼)該實(shí)驗(yàn)疫苗的免疫原性,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,后者誘導(dǎo)了與前者相近的系統(tǒng)細(xì)胞及體液免疫,但所誘導(dǎo)的眼表粘膜免疫應(yīng)答(sIgA),后者明顯強(qiáng)于前者;在進(jìn)一步的病毒攻擊實(shí)驗(yàn)中,眼表粘膜接種組的HSK病變亦明顯輕于肌肉系統(tǒng)接種組。
　　 最后,本研究最終采用眼表粘膜接種(局部滴眼)方式接種納米復(fù)合物PEI-Fe3O4為載體的DNA疫苗pRSC-gD-IL-21,其疫苗目的基因編碼的

9、蛋白在鼠體眼角膜活體表達(dá)的量及強(qiáng)度均明顯強(qiáng)于單純DNA疫苗pRSC-gD-IL-21;小鼠動(dòng)物免疫結(jié)果亦顯示,納米復(fù)合物實(shí)驗(yàn)疫苗所誘導(dǎo)的系統(tǒng)細(xì)胞、體液免疫、局部粘膜免疫以及非特異性固有免疫,都明顯強(qiáng)于單純pRSC-gD-IL-21等各對(duì)照疫苗;更主要的是,在HSK動(dòng)物模型中,其能較有效地抵抗HSV-1眼部感染,從而使預(yù)防HSK的效應(yīng)大大強(qiáng)于其它各對(duì)照組。
　　 上述研究表明:眼表粘膜接種(局部滴眼)納米復(fù)合物PEI-Fe3O4為