皺瘤海鞘抗單純皰疹病毒Ⅱ型活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、海鞘(Ascidian)是尾索動(dòng)物亞門(Uro-chordata)海鞘綱(Ascidiacea)的尾索動(dòng)物,主要分布在熱帶及亞熱帶海域,海鞘中含有許多有生理活性的化合物,這些活性化合物有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等作用。皺瘤海鞘Styela plicata在我國(guó)南海有大量分布,研究皺瘤海鞘的藥用價(jià)值,對(duì)開發(fā)利用我國(guó)的這一豐富資源具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 目的：課題組前期研究發(fā)現(xiàn)皺瘤海鞘在體內(nèi)外對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)都有一定的抑制作

2、用,顯示出良好的研究和開發(fā)前景。因此,本課題擬對(duì)皺瘤海鞘對(duì)同是具有包膜的DNA病毒單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)藥效活性和作用機(jī)制進(jìn)行研究。為進(jìn)一步了解皺瘤海鞘的抗病毒譜,為新型抗病毒藥物的研究和開發(fā)提供理論依據(jù),為皺瘤海鞘的進(jìn)一步深入研究和開發(fā)利用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.皺瘤海鞘體外抗HSV-2藥效學(xué)研究運(yùn)用HSV-2在非州綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)上的增殖模型,通過(guò)觀察細(xì)胞病變(CPE法)和四甲

3、基偶氮唑鹽比色法(MTT比色法)檢測(cè)細(xì)胞活性,以病毒抑制率和治療指數(shù)(TI)為指標(biāo)對(duì)皺瘤海鞘體外抗HSV-2的藥效活性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 2.皺瘤海鞘體外抗HSV-2病毒作用機(jī)制研究運(yùn)用HSV-2在Vero細(xì)胞上的增殖模型,在HSV-2復(fù)制的不同階段用藥物進(jìn)行干預(yù),運(yùn)用CPE法結(jié)合MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率,以病毒抑制率和TI為指標(biāo)考察了藥物在體外對(duì)HSV-2病毒直接殺傷作用、對(duì)HSV-2吸附的阻斷作用、對(duì)HSV-2病毒生物合

4、成的抑制作用和在不同時(shí)間點(diǎn)加入藥物對(duì)HSV-2復(fù)制的抑制作用；運(yùn)用熒光定量PCR方法,從分子水平上探討了皺瘤海鞘對(duì)HSV-2DNA雙鏈復(fù)制的影響；運(yùn)用RT-PCR方法進(jìn)一步研究皺瘤海鞘對(duì)HSV-2DNA聚合酶基因表達(dá)的影響。
　　 3.皺瘤海鞘對(duì)陰道感染HSV-2小鼠的保護(hù)作用運(yùn)用小鼠陰道感染HSV-2的致病模型,研究了皺瘤海鞘對(duì)小鼠生殖器皰疹的治療作用。以小鼠外陰病變程度評(píng)分和小鼠陰道粘膜組織病理學(xué)檢查為指標(biāo)評(píng)價(jià)皺瘤海鞘對(duì)生殖

5、器皰疹的治療作用。
　　 4.皺瘤海鞘體內(nèi)抗HSV-2作用機(jī)制研究運(yùn)用小鼠陰道感染HSV-2的致病模型,研究了皺瘤海鞘對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的的調(diào)節(jié)作用。在治療周期結(jié)束后,小鼠處死,取小鼠外周血抗凝,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CD4,CD8陽(yáng)性T細(xì)胞百分比,比較用藥后各組小鼠外周血T細(xì)胞亞群的差異,評(píng)價(jià)皺瘤海鞘對(duì)小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 運(yùn)用小鼠陰道感染HSV-2的致病模型,研究了皺瘤海鞘對(duì)小鼠Th細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用。在治療周期結(jié)束

6、后,小鼠處死,取小鼠外周血,收集血清,用酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定血清中IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10水平。比較用藥后各組小鼠外周血IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10的差異,評(píng)價(jià)皺瘤海鞘對(duì)小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 5.皺瘤海鞘抗HSV-2活性有藥效部位的篩選運(yùn)用HSV-2在Vero細(xì)胞上的增殖模型,以CPE法和MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性。以細(xì)胞存活率和半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)為指標(biāo)考察藥物的細(xì)胞毒性；以

7、病毒抑制率為指標(biāo),對(duì)皺瘤海鞘氯仿部位、正丁醇部位,水部位體外抗HSV-2的藥效活性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)；以病毒抑制率為指標(biāo)考察了皺瘤海鞘水部位在體外對(duì)HSV-2病毒直接殺傷作用、對(duì)HSV-2吸附的阻斷作用以及對(duì)HSV-2病毒生物合成的抑制作用。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本文所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析方法進(jìn)行,先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),若方差齊,則應(yīng)用One-way ANOVA方法進(jìn)行整體檢驗(yàn),用LSD方法進(jìn)行組間多重比較,若方差不齊,則

8、應(yīng)用Welch方法進(jìn)行整體檢驗(yàn),用DunnettT3方法進(jìn)行組間多重比較。等級(jí)資料數(shù)據(jù)應(yīng)用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05,可認(rèn)為組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理。
　　 結(jié)果：
　　 1.藥物對(duì)Vero細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與細(xì)胞對(duì)照組比較,皺瘤海鞘各組吸光度值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),ACV組在1mg/ml濃度以下各組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。皺瘤海鞘對(duì)Vero細(xì)胞的毒性

9、作用小,在10mg/ml濃度下細(xì)胞存活率仍有74.88％,其對(duì)Vero細(xì)胞的CC50值大于10mg/ml,陽(yáng)性對(duì)照藥ACV的CC50為1.57mg/ml。
　　 2.藥物對(duì)HSV-2致細(xì)胞病變的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,皺瘤海鞘各組吸光度值與病毒對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),陽(yáng)性對(duì)照藥阿昔洛韋(acylovir,ACV)0.01～0.04 mg/ml組吸光度與病毒對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。皺瘤海鞘對(duì)H

10、SV-2的半數(shù)有效濃度(EC50)為0.40mg/ml,TI>25,對(duì)HSV-2感染Vero細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的保護(hù)作用；ACV50％病毒抑制率藥物濃度EC50=0.0067mg/ml,治療指數(shù)TI=224,對(duì)HSV-2顯示出較強(qiáng)的抑制作用。
　　 3.皺瘤海鞘對(duì)HSV-2直接殺傷活性應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,計(jì)算皺瘤海鞘對(duì)HSV-2病毒的抑制率。結(jié)果顯示,皺瘤海鞘在1 mg/ml時(shí)吸光度與病毒對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01

11、),在2和1mg/ml時(shí),其對(duì)病毒抑制率分別達(dá)74.19,64.52％,EC50為0.63mg/ml,TI值大于15.87。結(jié)果表明,皺瘤海鞘對(duì)病毒具有一定的直接殺傷活性。
　　 4.皺瘤海鞘對(duì)HSV-2增殖的影響運(yùn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,計(jì)算皺瘤海鞘對(duì)HSV-2病毒的抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,皺瘤海鞘2和1mg/ml組吸光度與病毒對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在2和1mg/ml時(shí),其對(duì)病毒的抑制率分別達(dá)82.98％和

12、65.96％,在0.25mg/ml時(shí),其對(duì)病毒抑制率也達(dá)29.79％。其EC50值為0.66mg/ml,TI值大于15.15,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,皺瘤海鞘對(duì)病毒復(fù)制具有一定的抑制作用。
　　 5.皺瘤海鞘對(duì)HSV-2吸附的阻斷作用運(yùn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,計(jì)算皺瘤海鞘對(duì)HSV-2病毒的抑制率。實(shí)驗(yàn)測(cè)得皺瘤海鞘各組吸光度值與病毒對(duì)照比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),經(jīng)計(jì)算求得,其在2mg/ml時(shí),其對(duì)病毒抑制率達(dá)只有23.08％,沒(méi)有

13、超過(guò)50％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示皺瘤海鞘對(duì)病毒的吸附?jīng)]有阻斷作用。
　　 6.在病毒感染前后不同時(shí)間點(diǎn)加入皺瘤海鞘對(duì)HSV-2病毒的影響運(yùn)用MTT法測(cè)定在不同時(shí)間點(diǎn)加入皺瘤海鞘對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用,計(jì)算皺瘤海鞘對(duì)HSV-2病毒的抑制率。結(jié)果顯示,在病毒感染前2小時(shí)和感染后0,2,4,6小時(shí)加入藥物,最后測(cè)得的吸光度值與病毒對(duì)照比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；病毒在感染后0,2小時(shí)加入藥物對(duì)病毒抑制率達(dá)65％以上,對(duì)病毒顯示出明顯的

14、抑制作用。在感染后4,6小時(shí)加入藥物,對(duì)病毒抑制率分別是41.27％,34.92％,在感染后10小時(shí)加入藥物,對(duì)病毒復(fù)制沒(méi)有抑制作用。
　　 7.熒光定量PCR方法測(cè)定皺瘤海鞘對(duì)HSV-2病毒DNA復(fù)制的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與病毒對(duì)照組比較,皺瘤海鞘2,1,0.5 mg/ml組能使HSV-2DNA拷貝數(shù)下降2-3個(gè)數(shù)量級(jí),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,皺瘤海鞘對(duì)HSV-2 DNA鏈復(fù)制有一定抑制作用。
　

15、　 8.RT-PCR法檢測(cè)皺瘤海鞘對(duì)HSV-2 DNA聚合酶UL30基因表達(dá)的影響RT-PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后,所有樣品均能擴(kuò)增出特異性的β-actin片段,在皺瘤海鞘(2mg/ml)組和ACV組的均能檢測(cè)到DNA聚合酶UL30 mRNA的表達(dá),但是與病毒對(duì)照組相比,表達(dá)量顯著降低,提示皺瘤海鞘對(duì)HSV-2DNA聚合酶的基因表達(dá)具有一定的干擾作用。
　　 9.皺瘤海鞘對(duì)小鼠生殖器皰疹的治療作用病毒攻擊后,經(jīng)過(guò)連續(xù)7天治療。實(shí)驗(yàn)

16、結(jié)果顯示,海鞘可明顯減輕陰道感染HSV-2小鼠外陰腫脹,縮短病程。與模型組比較,陽(yáng)性藥ACV組,海鞘高、低劑量組小鼠外陰病變?cè)u(píng)分都較小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小鼠陰道組織病理學(xué)檢查,光鏡下,正常組的陰道粘膜完整,沒(méi)有炎細(xì)胞浸潤(rùn),沒(méi)有損傷表現(xiàn)。模型組小鼠陰道粘膜損傷嚴(yán)重,有大量的出血點(diǎn),有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn):ACV組,皺瘤海鞘高、低劑組陰道粘膜損傷較輕,只有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),沒(méi)有出血點(diǎn)。結(jié)果表明,皺瘤海鞘對(duì)小鼠生殖器皰疹具有一定治

17、療作用。
　　 10.皺瘤海鞘對(duì)感染HSV-2小鼠外周血T細(xì)胞亞群的影響病毒攻擊后,連續(xù)給藥治療7天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組外周血中CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞百分比均具有顯著差異(P<0.01),可認(rèn)為造模后兩者均顯著減少,免疫功能受到一定抑制。ACV治療組、海鞘治療組和模型對(duì)照組相比,小鼠外周血中CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞百分比均有顯著差異(P<0.01),可認(rèn)為經(jīng)治療后,CD4+T細(xì)胞和CD8+

18、T細(xì)胞數(shù)量有了顯著提高。與空白對(duì)照組相比較,模型組外周血CD4+T細(xì)胞/CD8+細(xì)胞比值有顯著差異(P<0.01),可認(rèn)為模型組CD4+T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞平衡失調(diào)。ACV治療組、皺瘤海鞘治療組和模型對(duì)照組相比,外周血CD4+T細(xì)胞/CD8+細(xì)胞比值均具有顯著性差異(P<0.01,P<0.05),可認(rèn)為經(jīng)治療后,小鼠T細(xì)胞平衡失調(diào)得到明顯改善；與正常組比較,皺瘤海鞘治療組CD4+T細(xì)胞/CD8+細(xì)胞比值無(wú)顯著差異(P>0.05),ACV

19、治療組CD4+T細(xì)胞/CD8+細(xì)胞比值有顯著差異(P<0.01)。
　　 11.皺瘤海鞘對(duì)小鼠IL-2,IFN-γ細(xì)胞因子水平的影響病毒攻擊后,連續(xù)給藥治療7天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組小鼠血清IL-2水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較,皺瘤海鞘高、低劑量組小鼠血清IL-2水平均有顯著增加(P<0.01),可認(rèn)為皺瘤海鞘能提高小鼠IL-2的表達(dá)水平；與模型組比較,陽(yáng)性藥(ACV)組小鼠血清IL-2水平

20、有升高趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較,各組小鼠血清IFN-γ水平均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 12.皺瘤海鞘對(duì)小鼠IL-4,IL-10細(xì)胞因子水平的影響病毒攻擊后,連續(xù)給藥治療7天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比較,模型對(duì)照組小鼠血清IL-4,IL-10水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與模型組比較,陽(yáng)性藥(ACV)組小鼠血清IL-4,IL-10水平均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；皺瘤海鞘高、低劑量

21、組與模型組比較,小鼠血清IL-4,IL-10水平均具有顯著性差異(P<0.01,P<0.05),可認(rèn)為皺瘤海鞘能夠提高致病小鼠IL-4,IL-10水平。
　　 13.皺瘤海鞘不同部位對(duì)Vero細(xì)胞毒性MTT法測(cè)定皺瘤海鞘不同部位對(duì)Vero細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)測(cè)得皺瘤海鞘氯仿部位、正丁醇部位和水部位0.08～10mg/ml組吸光度值與細(xì)胞對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)；皺瘤海鞘氯仿部位對(duì)Vero細(xì)胞的CC50為

22、4.62mg/ml,皺瘤海鞘正丁醇部位對(duì)Vero細(xì)胞的CC50大于10mg/ml,皺瘤海鞘水部位對(duì)Vero細(xì)胞的CC50大于10mg/ml。
　　 14.皺瘤海鞘氯仿部位對(duì)HSV-2致細(xì)胞病變抑制效應(yīng)MTT法測(cè)定皺瘤海鞘氯仿對(duì)HSV-2致細(xì)胞病變抑制效果,結(jié)果顯示,各濃度組吸光度值與病毒對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),2mg/ml皺瘤海鞘氯仿部位對(duì)HSV-2抑制率為19.23％,沒(méi)有達(dá)到50％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,皺瘤海鞘氯

23、仿部位對(duì)HSV-2無(wú)抑制作用。
　　 15.皺瘤海鞘正丁醇部位對(duì)HSV-2致細(xì)胞病變抑制效應(yīng)MTT法測(cè)定皺瘤海鞘正丁醇部位對(duì)HSV-2致細(xì)胞病變抑制效果,結(jié)果顯示,各濃度組吸光度值與病毒對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),2mg/ml皺瘤海鞘正丁醇部位HSV-2抑制率為11.54％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,皺瘤海鞘正丁醇部位對(duì)HSV-2無(wú)抑制作用。
　　 16.皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2致細(xì)胞病變抑制效應(yīng)MTT法測(cè)定皺瘤海鞘

24、水部位對(duì)HSV-2致細(xì)胞病變抑制效果。結(jié)果顯示,2、1及0.5mg/ml濃度組吸光度值與病毒對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,<0.05),2,1mg/ml瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2病毒抑制率分別達(dá)到91.43％,77.14％,其EC50為0.67mg/ml,TI值大于14.93,結(jié)果表明,皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2具有一定抑制作用。
　　 17.皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2增殖的影響MTT法測(cè)定皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2增

25、殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,皺瘤海鞘水部分各濃組吸光度值與病毒對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),皺瘤海鞘水部位2、1和0.5mg/ml時(shí),其病毒抑制率分別達(dá)82.98,65.96和63.93％,EC50=0.49mg/ml,T>20.41。結(jié)果表明,皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2增殖具有一定抑制作用。
　　 18.皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2直接殺傷作用MTT法測(cè)定皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2直接殺傷作用,結(jié)果顯示,皺瘤海鞘水部位各

26、濃度組吸光度值與病毒對(duì)照組比較均無(wú)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),皺瘤海鞘水部位在2和1mg/ml時(shí),其病毒抑制率分別達(dá)74.29％,60.00％,EC50=0.80mg/ml,T>12.50。結(jié)果表明,皺瘤海鞘水部位對(duì)病毒具有一定的殺傷活性。
　　 19.皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2吸附的阻斷作用MTT法測(cè)定皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2吸附的阻斷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,皺瘤海鞘水部位各組吸光度值與病毒對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

27、,在2mg/ml時(shí),其病毒抑制率只有19.23％,沒(méi)有達(dá)到50％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明皺瘤海鞘水部位對(duì)HSV-2病毒吸附?jīng)]有阻斷作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.運(yùn)用細(xì)胞模型證實(shí)皺瘤海鞘對(duì)HSV-2復(fù)制具有抑制作用。
　　 2.運(yùn)用細(xì)胞模型證實(shí)皺瘤海鞘對(duì)HSV-2具直接殺傷作用,對(duì)HSV-2生物合成具有抑制作用,而對(duì)HSV-2吸附侵入細(xì)胞沒(méi)有阻斷作用。
　　 3.運(yùn)用細(xì)胞模型證實(shí)皺瘤海鞘對(duì)HSV-2 DNA鏈復(fù)制延

28、長(zhǎng)具有抑制作用,其作用靶點(diǎn)之一是抑制HSV-2DNA聚合酶基因表達(dá)。
　　 4.皺瘤海鞘能夠?qū)﹃幍栏腥綡SV-2小鼠生殖器皰疹具有治療作用。
　　 5.皺瘤海鞘能夠提高陰道感染HSV-2小鼠外周血液CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群百分比,調(diào)節(jié)小鼠T細(xì)胞亞群的平衡；能提高陰道感染HSV-2小鼠血液Th細(xì)胞因子水平,從而調(diào)節(jié)和改善小鼠的免疫功能。這些可能是其對(duì)生殖器皰疹具有治療作用一個(gè)有效機(jī)制。
　　 6.皺瘤海鞘提取物