江南卷柏提取物抗柯薩奇病毒和單純皰疹病毒的研究.pdf

1、江南卷柏(Selaginella moellendorfii Hieron)是卷柏科卷柏屬植物江南卷柏的干燥全草，為常用中草藥與民族藥[1]。具有清熱解毒、抗癌、止血之功效，用于癌癥、肺炎、急性扁桃體炎、眼結(jié)膜炎和乳腺炎等癥[2]。云南彝族主要用于治療黃疸型肝炎、肺結(jié)核咯血、全身浮腫等癥。鄂西土家族尚用于癌癥、腹瀉、淋病、小兒驚風(fēng)、吐血、便血、崩漏、痔瘡出血，外用則治燒燙傷、外傷出血。并且，以本品為原料制得的江南卷柏片對原發(fā)性血小板減少

2、性紫癲、過敏性紫癲、繼發(fā)性紫癲及多種出血癥均有良效[3]。 目前，中外植物化學(xué)工作者已從卷柏屬植物中分離出黃酮類、生物堿類、酚類、有機酸類、氨基酸及多糖類等多種化學(xué)成分[4]。其研究工作主要集中在植物的乙酸乙酯及正丁醇萃取部位，并從前者中成功分離了幾十個黃酮類化合物，且除芹菜素外大多為雙黃酮類[5]。其中，穗花杉雙黃酮(amentoflavone)不僅含量通常為最高，且最早即被1971年Okigawa，等人從卷柏中分離得到[6]

3、。 我們課題組從卷柏屬植物分離得到19個雙黃酮化合物、1個黃酮類化合物和1個黃酮苷化合物，其中5個為新化合物，15個成分為首次從這些植物中發(fā)現(xiàn)，它們都具有一定程度抑制XOD、LOX或/和COX-2的活性；發(fā)現(xiàn)穗花衫雙黃酮、羅波斯塔黃酮和羅波斯塔黃酮—4ˊ—甲醚3種雙黃酮成分為卷柏屬植物共同的特征性成分，它們具有不同程度的抗氧化、抗病毒或抗腫瘤活性，是共同的活性指標(biāo)成分。其中從江南卷柏的活性部位分離得到了6個雙黃酮類化合物，經(jīng)鑒定

4、為雞毛松雙黃酮A(7，4′，7″—tri—O—methylrobustaflavone，Ⅰ)、雞毛松雙黃酮B(7，7″—di—O—methylrobustaflavone，Ⅱ)、羅波斯塔黃酮-4′-甲醚(4'—O—methylrobustaflavone，Ⅲ)、羅波斯塔黃酮(robustaflavone，Ⅳ)，扁柏雙黃酮(hinokiflavone，Ⅴ)和穗花杉雙黃酮(amentoflavone，Ⅵ)。其中，化合物Ⅰ—Ⅴ為首次從江南卷柏

5、中分離得到，化合物Ⅰ和Ⅱ(雞毛松雙黃酮A和B)屬于羅波斯塔黃酮類，只被報道發(fā)現(xiàn)于裸子植物羅漢松科羅漢松屬的雞毛松(Podocarpus imbricatus)，這是首次從其它植物和卷柏屬植物中分離得到[7]。 研究中還發(fā)現(xiàn)，卷柏屬植物江南卷柏、細(xì)葉卷柏及薄葉卷柏等均具有良好的體外抗柯薩奇病毒效果[8]。其中，江南卷柏的乙酸乙酯提取物不僅可直接殺死病毒，還能有效抑制病毒的生物合成[9]。而乙酸乙酯部位的主要特征成分之一是黃酮類化合

6、物，故我們從江南卷柏藥材中提取出有效部位總黃酮成分，并考察其工藝和質(zhì)量，從而初步制定江南卷柏總黃酮提取物的制備工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。然后，以此提取物進行了多次體外和體內(nèi)抗柯薩奇病毒(CVB3)和單純皰疹病毒(HSV—Ⅰ)的研究，取得了肯定且可靠的效果。 首先，在江南卷柏提取物制備工藝方面，我們通過單因素試驗考察其粗提方法，確定為乙醇回流法；再以總黃酮提取量和浸膏得率為考察指標(biāo)，用正交試驗法對乙醇回流提取工藝進行考察，確定其最佳工藝條件

7、為藥材9倍量的85％乙醇回流提取2次，每次1小時；接著以穗花杉雙黃酮提取量和浸膏得率為考察指標(biāo)，用正交試驗法對醇提物的石油醚脫脂工藝進行考察，確定其最佳工藝條件為用原藥材6倍量的石油醚回流提取2次，每次1小時；脫脂后以低濃度稀醇溶液溶解過濾，再用大孔樹脂進行純化分離，得到最終產(chǎn)品：總黃酮粉末。具體即以總黃酮的含量和回收率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗對樹脂的型號、藥材上樣量、洗脫劑濃度和體積、洗脫流速及樹脂重復(fù)使用次數(shù)進行考察，確定其最佳工

8、藝為用D101型大孔樹脂對其進行吸附純化，樹脂量：藥材量為3：1，以8BV70％乙醇溶液在2BV/h的流速進行洗脫，樹脂的重復(fù)使用次數(shù)為3次。 在江南卷柏提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面，以紫外分光光度法和高效液相色譜法對提取物的總黃酮含量及穗花杉雙黃酮含量進行測定，并進行方法學(xué)考察，規(guī)范以上述制備工藝所制得總黃酮提取物，其總黃酮含量不少于50.0％，穗花杉雙黃酮含量不少于35.0％。 同時，我們還制定了江南卷柏藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確定其

9、名稱、來源、性狀，鑒別、含量測定、炮制、性味歸經(jīng)、功能與主治、用法與用量及貯藏。在含量測定中，是以穗花杉雙黃酮為對照品，采用高效液相色譜法，測定穗花杉雙黃酮的含量，并進行了方法學(xué)考察。最后暫定本品以干燥品計含穗花杉雙黃酮不得少于0.30％。 接著，對江南卷柏提取物的體外抗病毒作用進行了研究。我們選擇柯薩奇病毒(CVB3)及單純皰疹病毒(HSV—Ⅰ)，根據(jù)其復(fù)制周期，設(shè)計藥物抗病毒作用的三種途徑(抗病毒吸附、對病毒直接滅活、對病毒

10、增殖的抑制作用)，分三個處理組進行試驗。細(xì)胞毒性試驗表明，江南卷柏提取物的TC50為60μg/ml。故在此范圍內(nèi)確定5，10，20，30，40，50μg/ml作為藥物終濃度進行抗病毒試驗。實驗結(jié)果顯示，抗CVB3效果方面，其直接滅活病毒作用的IC50為36μg/ml，最高病毒抑制率為60％，TI為1.7；其抑制病毒增殖作用的IC50為16μg/ml，最高病毒抑制率為70％，TI為3.8?？笻SV—Ⅰ效果方面，其直接滅活病毒作用的IC50

11、為21μg/ml，最高病毒抑制率為80％，TI為2.9；其抑制病毒增殖作用的IC50為12μg/ml，最高病毒抑制率為90％，TI為5.1。實驗結(jié)果說明江南卷柏提取物不僅細(xì)胞毒性較低，且具有較好的直接殺死病毒和抑制病毒生物合成的作用，其生物效價較高。 最后，我們對江南卷柏提取物在體內(nèi)抗柯薩奇病毒的療效進行了重點研究。小鼠的動物急性毒性試驗表明，當(dāng)以0.2ml/10g一次性灌胃、給藥濃度依次為4.0，5.0，6.3，7.9，10m

12、g/g時，其死亡率分別為10％，30％，60％，80％，100％，故確定江南卷柏標(biāo)準(zhǔn)提取物的LD50為6.2mg/g。則在此范圍內(nèi)確定0.9，0.3，0.1mg/g作為高、中、低三種藥物濃度進行抗病毒治療。 選取小鼠(km SPF級雄性，體重10±2g)作為試驗動物，用0.2mlCVB3原液(TCID50為10-7)腹腔注射建立了病毒感染誘發(fā)小鼠病毒性心肌炎致病模型，然后分別設(shè)立高、中、低三種濃度的藥物治療組，正常對照組，病毒模

13、型對照組和阿昔洛韋陽性藥物對照組，于病毒感染后24h開始治療，采取灌胃給藥形式，每日一次，其余各組則采用生理鹽水灌胃，每日一次，連續(xù)治療15天。結(jié)果表明，當(dāng)藥物濃度為0.1mg/g時，其治愈率為30％，死亡率為50％；當(dāng)藥物濃度為0.3mg/g時，其治愈率為50％，死亡率為20％；當(dāng)藥物濃度為0.9mg/g時，其治愈率為70％，死亡率為10％。綜合各項考察指標(biāo)，結(jié)果顯示總黃酮提取物能有效抑制柯薩奇病毒在小鼠體內(nèi)的增殖，保護其臟器組織，明

14、顯減輕發(fā)病癥狀，推遲死亡時間，降低死亡率，治療呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。 本文研究發(fā)現(xiàn)，江南卷柏提取物的細(xì)胞毒性(TC50為60μg/ml)和動物毒性(LD50為6.2mg/g)均較小，在體外有顯著抑制柯薩奇病毒和單純皰疹病毒增殖的作用，體內(nèi)能有效地治療柯薩奇病毒感染誘發(fā)的病毒性心肌炎小鼠，是一種新的潛在性有效的抗柯薩奇病毒和單純皰疹病毒的藥物。江南卷柏在民間已經(jīng)用于多種病毒性疾病，本研究為治療危急性的病毒性心肌炎提供了新的依據(jù)和希望