環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測單純皰疹病毒DNA方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、目的：建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低，適于基層檢測孕婦血清中HSV DNA的方法，并初步評價該技術(shù)在臨床應(yīng)用價值。 方法：分別設(shè)計了HSV—Ⅰ和HSV—Ⅱ型特異的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop—mediated isothermal amplification LAMP）引物，并利用該技術(shù)建立了快速檢測HSV DNA的反應(yīng)體系。并針對影響LAMP反應(yīng)的因素，對反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，確定了LAMP檢測HSV DNA的最佳反應(yīng)條件，初步

2、鑒定了我們所建立方法的敏感性和特異性。在此基礎(chǔ)上，對我們所收集的96例孕婦外周血標(biāo)本進(jìn)行了檢測，并與傳統(tǒng)的ELISA和熒光定量PCR做了比較。 結(jié)果：通過對LAMP檢測HSV DNA反應(yīng)體系的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫度是LAMP最大的影響因素，甜菜堿也是LAMP反應(yīng)能否進(jìn)行的關(guān)鍵因素，鎂離子等其他因素相對溫度和甜菜堿的影響較小。特異性鑒定結(jié)果表明僅單純皰疹病毒型特異性檢測為陽性，而對同屬的其他類型的皰疹及人類基因組DNA檢測均為陰性

3、，酶切鑒定結(jié)果進(jìn)一步證明了擴(kuò)增的特異性。敏感性檢測下限為每反應(yīng)管（25μl的反應(yīng)體系）10個拷貝。對96例孕婦血清標(biāo)本分別進(jìn)行HSV—Ⅰ DNA和HSV—Ⅱ DNA檢測，HSV—Ⅰ陽性例數(shù)為9例，HSV—Ⅱ陽性例數(shù)為16例，并與ELISA和FQ—PCR檢測結(jié)果作比較。以FQ—PCR為檢測金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP與FQ—PCR陽性符合率大于94％，兩種方法差異不顯著（P>0．01）；而ELISA與FQ—PCR相比，存在顯著性差異（P<0．01）。