草魚(yú)呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)檢測(cè)方法的建立.pdf

1、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖品種，具有生長(zhǎng)速度快、飼料來(lái)源廣、養(yǎng)殖成本低、味道鮮美等優(yōu)點(diǎn)，深受養(yǎng)殖者與消費(fèi)者歡迎。但草魚(yú)易患多種疾病，嚴(yán)重阻礙了草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。草魚(yú)出血病是養(yǎng)殖草魚(yú)魚(yú)種階段最為嚴(yán)重的傳染性疾病，其病原為草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)，給草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大損失。草魚(yú)出血病流行范圍廣、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，傳播速度快，發(fā)病率與死亡率高，且治療方法有

2、限，只能以防為主，因此，建立草魚(yú)出血病的快速檢測(cè)方法對(duì)草魚(yú)健康養(yǎng)殖具有十分重要的意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)技術(shù)是一種新型的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)不需要變溫過(guò)程，在Bst聚合酶的作用下恒溫即可進(jìn)行反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單且擴(kuò)增率高，特異性強(qiáng)，在LAMP的基礎(chǔ)上，只需加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可完成對(duì)RNA的一步法逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reverse transcription

3、loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)。
　　 針對(duì)GCRV104株的S8節(jié)段序列(HM234682.2)設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、Mg2+濃度、Betaine濃度、dNTPs濃度、引物濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了GCRV的RT-LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)結(jié)果觀(guān)察方法、反應(yīng)靈敏度和特異性等進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，在此基礎(chǔ)上用建立的RT-LAMP方法對(duì)疑

4、似患草魚(yú)出血病的草魚(yú)樣本進(jìn)行了檢測(cè)。研究結(jié)果表明，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間、Mg2+濃度、引物濃度是影響LAMP擴(kuò)增的關(guān)鍵因素，其中最佳擴(kuò)增時(shí)間為60 min，最佳Mg2+濃度為6 mmol/L，最佳引物濃度為內(nèi)引物1.6μmol/L，外引物0.2μmol/L。其它條件對(duì)RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的影響較小。該方法具有良好的特異性，檢測(cè)限為33 pg病毒核酸，靈敏度比RT-PCR法高10倍，與斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒(CRV)、鯉魚(yú)春季病毒血癥病毒(SVC