豬腦心肌炎病毒的分離鑒定及RT-LAMP快速檢測方法的建立.pdf

1、腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的多種脊椎動物以腦炎、心肌炎、心肌周圍炎及繁殖障礙為主要臨床特征的急性人畜共患傳染病。臨床上,腦心肌炎病毒感染最嚴(yán)重和最廣泛的動物是豬,可引起仔豬致死性心肌炎,造成急性死亡,死亡率最高可達(dá)100％；導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎。人感染后可呈現(xiàn)輕度腦炎癥狀。腦心肌炎不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時也危害著人類的健康。
　　

2、 本研究對河北地區(qū)發(fā)病豬場疑似豬腦心肌炎病料進(jìn)行大量采集并處理,接種到BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng),通過RT-PCR技術(shù),序列測定,病毒感染力的測定及理化特性實(shí)驗進(jìn)行鑒定。實(shí)驗結(jié)果:分離得到的病毒能夠在BHK-21細(xì)胞上生長,細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、崩解等病變； RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果得到286bp的目的片段,與預(yù)期的結(jié)果一致；序列測定分析結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果相同,其核酸序列及氨基酸序列與GenBank公布的其他EMCV毒株的序列同源性為100

3、％；該株EMCV不耐酸,對氯仿和胰蛋白酶不敏感,不耐熱,該毒株在50℃,1h的條件下喪失活性。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)通過具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶完成靶序列的擴(kuò)增,僅需恒溫就能擴(kuò)增DNA,并可通過核酸染料染色觀察結(jié)果。對RNA病毒不需要單獨(dú)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),可以直接在同一反應(yīng)管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增(RT-LAMP)反應(yīng)。本研究將R

4、T-LAMP技術(shù)用于EMCV的檢測中,根據(jù)GenBank公布的豬腦心肌炎病毒基因序列,對其進(jìn)行序列比對篩選保守序列。最后針對GenBank X74312毒株的保守序列(6232bp-6441bp)篩選并驗證RT-LAMP特異性引物。引物合成后初步建立RT-LAMP反應(yīng),對反應(yīng)結(jié)果用Hinf I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定,并對所建立的RT-LAMP反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化；對RT-LAMP方法的靈敏度和特異性以及重復(fù)性與穩(wěn)定性進(jìn)行了檢驗。同時

5、,分別用本試驗建立的RT-PCR和RT-LAMP方法對36份提取的RNA樣品進(jìn)行檢測。實(shí)驗結(jié)果表明,RT-LAMP最佳反應(yīng)溫度是63℃,反應(yīng)時間為50min；最佳反應(yīng)體系(25μL)為:內(nèi)引物(FIP和BIP)各2.5μL,外引物(F3和B3)各0.5μL,3μL dNTPs(2.5mM),2.5μLMgCl2(25mM),2.5μL10×Bst DNA Buffer,1.5μL Bst DNA聚合酶,2μL RNA提取物和6μL DE