豬流行性腹瀉病毒實時熒光RT-LAMP檢測方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，該病對全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。目前，實驗室常用的檢測PEDV的方法有RT-PCR和ELISA等，但由于其需要專業(yè)人員和昂貴的儀器設(shè)備而在臨床使用中受到限制。實時熒光逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）具有快速、靈敏等優(yōu)點，

2、目前國內(nèi)外尚無檢測PEDV的實時熒光RT-LAMP檢測方法。
　　本研究從保定某發(fā)病豬場采集疑似PEDV的糞便樣本，將處理好的樣本接種Vero細(xì)胞，盲傳至第五代時，細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯的CPE，通過RT-PCR及測序結(jié)果證實該分離毒為PEDV，命名為HB-LX株。利用該毒株，根據(jù)GenBank中已登錄的PEDV基因序列，在其N基因保守區(qū)域設(shè)計了6條實時熒光RT-LAMP引物，利用ESE-QuantTube Scanner檢測系統(tǒng)，對實

3、時熒光RT-LAMP內(nèi)外引物的濃度比，鎂離子、dNTPs、Bst DNA聚合酶、螯合劑的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，25μL反應(yīng)體系中，固定外引物F3、B3的量各為0.5μL，當(dāng)外引物與內(nèi)引物的量為1∶4，螯合劑的量為1.0μL，Bst DNA聚合酶的量為0.5μL，Mg2+的量為1.0μL，dNTPs的量為5.0μL時，62℃，反應(yīng)1hr，擴(kuò)增效果良好。利用優(yōu)化的反應(yīng)體系與條件進(jìn)行了特異性和靈敏性試驗。結(jié)果表明，該檢測方法特異性好，敏感