豬流行性腹瀉病毒COE抗原表位的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的高度接觸性的腸道傳染病,在全世界范圍流行,各種年齡豬均易感,發(fā)病率和死亡率均很高,造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　從2010年開始,PED單獨(dú)或與其他病原(因)混合感染,引起我國各種規(guī)模豬場(chǎng)哺乳仔豬嚴(yán)重腹瀉,發(fā)病率與死亡率均顯著升高。疫苗免疫是防治PED的重

2、要手段。然而PEDV因體外培養(yǎng)困難,容易出現(xiàn)疫苗病毒含量不足現(xiàn)象,造成免疫失敗。另外,PEDV弱毒疫苗給乳豬早期使用存在殘余毒力致病的風(fēng)險(xiǎn)。因此,PEDV基因工程苗的研制對(duì)防治PED具有重要意義。另外,國內(nèi)外使用的PEDV診斷試劑大多是以全病毒為抗原,但PEDV的分離及體外培養(yǎng)較困難,使得大量制備抗原變得困難。綜合上述,本試驗(yàn)對(duì)近年流行的PEDV毒株的S基因的保護(hù)性抗原(COE)的保守性進(jìn)行了進(jìn)一步遺傳學(xué)分析,用COE原核表達(dá)蛋白建立了

3、PEDV的間接ELISA診斷技術(shù),并為PEDV新型基因工程疫苗制備提供了理論與物質(zhì)基礎(chǔ)。研究內(nèi)容如下:
　　(1)本試驗(yàn)根據(jù)GenBank收錄的PEDVCV777株全基因序列(登錄號(hào)為AF353511)設(shè)計(jì)一對(duì)COE的特異性引物P1、P2,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出501bp的COE抗原表位片段,并成功將目的基因插入原核表達(dá)載體pET-32α中,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32α-COE。將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32α-COE轉(zhuǎn)化入表

4、達(dá)宿主菌E.coil Rosetta中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE蛋白電泳后,結(jié)果顯示目的基因片段在E.coil Rosetta中得到表達(dá),目的蛋白分子量約為40kD。對(duì)包涵體提取純化后得到純度較高的重組蛋白,Western-blotting檢測(cè)結(jié)果表明重組蛋白具有良好的免疫原性。該研究為PED診斷試劑及基因工程疫苗研究奠定了物質(zhì)與技術(shù)基礎(chǔ)。
　　(2)本試驗(yàn)將純化后的重組COE蛋白作為包被抗原,通過優(yōu)化間接ELISA檢