豬流行性腹瀉病毒的分離及間接ELISA的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是世界范圍內(nèi)發(fā)生的豬病之一，1978年在英國和比利時首次被報道，此后歐洲、亞洲的多個國家相繼報道了PED的發(fā)生，造成嚴重的經(jīng)濟損失。當前，PED發(fā)生率居高不下，并出現(xiàn)混合感染的報道（如豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒、豬圓環(huán)病毒2型），倍受廣大研究者的重視。本研究對豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)進行分離鑒定和

2、分子流行病學(xué)調(diào)查及建立其抗體的間接ELISA診斷方法，以進一步了解PEDV廣西流行毒株的特點，為下一步研制PEDV疫苗、制備診斷試劑盒提供理論指導(dǎo)，為更好地防控PED奠定基礎(chǔ)。
　　 了解當前PEDV在廣西的流行情況，本研究用RT-PCR方法對2011年2月至2013年1月間從廣西11個市采集的240份腹瀉仔豬樣品進行PEDV檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV陽性率為41.7％(100/240)，四個季度均存在PEDV的感染，其中春、冬季節(jié)的檢

3、出率最高，分別為49％和46.2％。調(diào)查結(jié)果表明，在廣西大部分地區(qū)的豬群中普遍存在流行性腹瀉病毒感染。對陽性材料進行克隆，獲得了14條M基因序列和20條ORF3基因序列。用DNAStar、MEGA5.0軟件將其與國內(nèi)外相應(yīng)的基因序列進行比較分析發(fā)現(xiàn)，本實驗所獲得的M、ORF3序列差異較大，它們與2010年以來我國廣東、福建、江蘇、江西四省的同源性均較高，與泰國、韓國2007年以來的流行毒株親緣關(guān)系也非常密切，但與我國2006年前分離的毒

4、株及CV777株、日韓弱毒株較遠。且在從腹瀉仔豬樣品克隆所得的序列中，有1條M基因序列與CV777疫苗株相近，有3條ORF3序列與CV777、attenuated-DR13疫苗株存在相似的49個核苷酸的連續(xù)缺失。這些結(jié)果提示我們要加強對PEDV的研究與監(jiān)控，采取更有針對性的免疫與防控措施。本次研究是首次對廣西當前的流行毒株進行比較深入的分子流行病學(xué)調(diào)查。
　　 為進一步了解廣西流行毒株的生物學(xué)特性，研究通過用VERO細胞對40份

5、陽性材料進行分離，經(jīng)RT-PCR鑒定和間接ELISA鑒定，獲得一株能穩(wěn)定傳代并能使細胞發(fā)生空泡化、溶解、相互融合、出現(xiàn)拉網(wǎng)等細胞病變的毒株，命名為PEDV-LB。對其S、ORF3、M、N4個基因進行克隆測序，并將其與國內(nèi)外相應(yīng)的基因序列進行同源性比較與遺傳進化樹分析，發(fā)現(xiàn)ORF3基因、M基因與CV777等弱毒株比較相近;N基因與CH/GDS/09，親緣關(guān)系最近，與CV777不在同一分支上;S基因變異較大，與我國2011年的流行毒株同源關(guān)

6、系較近，與CV777等距離較遠。根據(jù)CV777全基因序列設(shè)計引物進一步對PEDV-LB株全基因進行克隆，結(jié)果獲得了除5'端、3'端及部分Pol基因外的全基因大部分核苷酸序列，共25，094bp。
　　 為了建立PEDV抗體檢測的間接ELISA診斷方法，本研究對廣西流行毒株的N基因進行克隆，設(shè)計合成引物擴增其局部強親水性抗原決定簇基因區(qū)域（135-319位氨基酸）NB，構(gòu)建了NB-PET32a-BL21重組原核表達質(zhì)粒，經(jīng)IPTG

7、誘導(dǎo)獲得重組N蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明表達產(chǎn)物部分可溶，經(jīng)Western-Blot鑒定，表達的重組N蛋白含有His-Tag，能夠被抗His的抗體識別，還能PEDV陽性血清所識別，具有良好的抗原性。將純化的重組N蛋白包作為抗原包被酶標板，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。用該方法對廣西不同地區(qū)的12個豬場的704份血清樣品進行檢測，結(jié)果它們的陽性率為31.4％～92.9％。該診斷方法具有準確、快速、操