豬流行性腹瀉病毒主要結(jié)構(gòu)基因遺傳變異分析及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhca，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引起的一種豬的急性、高度接觸性傳染病，以腹瀉、嘔吐、脫水等為主要臨床特征特征，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。臨床上該病與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒病癥狀相似，較難進(jìn)行鑒別診斷。為了探究PEDV的分子流行病學(xué)特點(diǎn)并建立有效的診斷方法，本研究主要開展了以下幾個(gè)方面的工作:

2、　　1.PEDV主要結(jié)構(gòu)基因的遺傳變異分析
　　2013-2014年于北京、河南、陜西、廣東、山東5個(gè)省市采集的豬流行性腹瀉(PED)陽性病料，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)結(jié)構(gòu)基因S、M、N進(jìn)行克隆及測(cè)序，與國(guó)內(nèi)外主要毒株進(jìn)行比較，分析序列變化和遺傳變異情況。序列比對(duì)結(jié)果顯示，1株為弱毒株，其余4個(gè)樣品株的S基因與國(guó)內(nèi)疫苗株CV777差異較大，突變主要存在于S1區(qū)。S基因氨基酸序列存在5個(gè)氨基酸的插入(59QGVN62 and140N)和2個(gè)

3、氨基酸的缺失(163NI164)，S1區(qū)的2個(gè)中和表位(499～638aa和764～771aa)有7處氨基酸突變。M、N基因的核苷酸序列相對(duì)保守，只存在部分氨基酸突變。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，4個(gè)樣品株與亞洲主要疫苗株（中國(guó)疫苗株CV777、韓國(guó)弱毒疫苗株DR13以及日本弱毒疫苗株83P-5）同源性較低(93.8％～94.7％)，親緣關(guān)系較遠(yuǎn);與2007～2009年韓國(guó)毒株，2011年日本毒株以及中國(guó)近年流行毒株同源性較高(96.0％～9

4、9.6％)，親緣關(guān)系密切。
　　2.PEDV BJ-1株M、N、S1融合蛋白的表達(dá)和抗原性分析
　　將樣品株BJ-1的M、N和S1基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示M、N、S1重組蛋白獲得表達(dá)，大小分別為50KDa、80KDa、110KDa，以包涵體表達(dá)形式為主。Western blot分析結(jié)果表明3種重組蛋白能被PEDV豬陽性血清特異性識(shí)別，具

5、有良好的抗原性，可以作為診斷抗原用于特異性檢測(cè)PEDV感染。
　　3.PEDV N蛋白間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立
　　以純化重組PEDV N蛋白作為包被抗原，優(yōu)化各項(xiàng)反應(yīng)條件，初步建立了可以檢測(cè)PEDV血清中N蛋白抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。本研究中最終優(yōu)化的反應(yīng)條件為:N蛋白的最佳包被濃度為0.5μg/mL,最佳包被時(shí)間為37℃2h后4℃過夜(10～16h)，5％脫脂牛奶37℃封閉3h，血清樣品最佳稀釋度為1∶40

6、0，37℃作用1h，兔抗豬酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶40，000，37℃作用1h，抗體臨界值為OD450nm≥0.40判為陽性，OD450nm＜0.40判為陰性。試驗(yàn)證明該方法具有較好的敏感性、特異性、重復(fù)性和符合率，表明PEDV N蛋白間接ELISA抗體檢測(cè)方法初步建立，可以用于豬PEDV血清抗體的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
　　綜上所述，本研究分析了PEDV樣品株結(jié)構(gòu)基因中M、N、S的序列變化和遺傳變異情況，為研究PEDV毒株的變異情