牛病毒性腹瀉病毒NS3基因片段的原核表達及間接ELISA檢測方法的初步建立.pdf

1、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV)屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員。該病毒可引起牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD)，主要感染牛，還可感染羊、豬、鹿、駱駝及一些野生反芻動物。牛羊臨床癥狀主要表現(xiàn)為粘膜發(fā)炎、糜爛、壞死，腹瀉和隱性感染。該病呈世界性分布，尤其是歐美等養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達的國家。目前，本病分布于我國所有的區(qū)域，也沒有疫苗預(yù)防，BVD診斷和監(jiān)測技術(shù)儲備嚴(yán)重不足。近年來，在用細胞生產(chǎn)的疫苗和發(fā)病豬群中

2、發(fā)現(xiàn)了病原的污染，因此，開展BVDV監(jiān)測技術(shù)的研究，界定發(fā)病豬群BVDV的來源、危害程度顯得尤為重要。
　　 本研究中采用RT-PCR及套式PCR方法，對來自浙江、湖南、安徽、江西、廣西、遼寧等地的豬病料進行BVDV檢測，以其對目前我國豬群中BVDV感染情況及其來源進行評價。結(jié)果6省43份豬病料中7份呈BVDV陽性，陽性率為16.3％，說明我國豬群中BVDV的感染情況已經(jīng)比較嚴(yán)重，應(yīng)該予以重視。為追蹤BVDV在豬體中的流行來源，

3、我們又對細胞培養(yǎng)用國產(chǎn)及進口犢牛血清及8份豬用細胞疫苗進行了檢測，結(jié)果均能擴增到目的條帶。序列分析表明:血清及疫苗中毒株與上述各省野毒株同源性非常高，提示我們豬群感染的BVDV可能來源于豬用疫苗及細胞苗培養(yǎng)用的犢牛血清。
　　 本文還根據(jù)已發(fā)表BVDV標(biāo)準(zhǔn)株Oregon c24v序列設(shè)計一對擴增NS3基因主要抗原區(qū)域的的特異性引物，用RT-PCR方法從Oregon c24v標(biāo)準(zhǔn)株病毒核酸中擴增得到573bp的目的基因，并將其克隆

4、到PGEM-Teasy載體中，測序鑒定閱讀框架正確后再亞克隆到表達載體pET-32a中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在E.coli BL21細菌中成功獲得表達。Western Blot結(jié)果顯示該重組蛋白可以被BVDV陽性血清識別，具有良好的抗原性。
　　 目的蛋白經(jīng)大量誘導(dǎo)表達，可溶性試驗證明重組蛋白以可溶性形式存在于超生裂解液上清中，用鎳柱親和層析法從上清中純化了目的蛋白。以純化后的目的蛋白作為抗原包被聚乙烯微量反應(yīng)板，初步建立檢測BVD